2型糖尿病模型大鼠肾小管间质中期因子及肝细胞生长因子的表达及相互关系

摘要

目的:
　　糖尿病肾病(DiabeticNephropathy，DN)是常见的糖尿病(DiabetesMellitus，DM)慢性并发症之一，是导致终末期肾衰的主要原因。糖尿病肾病的确切发病机制至今尚未阐明：糖代谢异常、氧化应激、脂代谢紊乱、细胞因子、遗传背景等导致肾小球的改变在DN的发病过程中起非常重要的作用。近来研究显示，DN时肾小管的损伤也尤为严重，而且DN肾功能恶化的程度与肾小管间质的损伤程度密切相关。中期因子(Midkine，MK)是肝素结合生长因子家族中的新成员，目前国外针对MK在肾脏疾病中的研究主要集中在急性肾损伤方面，而对其在慢性肾脏疾病，尤其是在DN中的作用研究很少。新近的研究表明，高糖可诱导MK的表达，而MK趋化巨噬细胞及中性粒细胞的移行，通过内皮组织进入间质组织，引起肾间质炎症反应，进而造成肾间质纤维化，在糖尿病肾病的发生发展中起重要作用。肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)是一种诱导、调节、抗纤维化因子，对肾脏纤维化起保护作用。目前有关MK参与DN的具体机制尚未阐明，其与HGF的关系也尚少见报道。Midkine反义寡聚脱氧核苷酸(antisenseoligodeoxynucleortides，MKAS-ODNs)是一种在MKmRNA水平上针对疾病分子机制合成的产物，静脉注射可以抑制MK的合成。本研究通过观察DN大鼠肾小管间质中期因子及肝细胞生长因子表达的动态变化，探讨两者之间的相互关系，并对DN大鼠进行midkine反义寡聚脱氧核苷酸干预，观察MKAS-ODNs对糖尿病肾病大鼠肾小管间质纤维化的作用。
　　方法:
　　66只健康清洁级雄性SD大鼠随机分为正常对照组(n=20只)、造模组(n=46只)，造模组采用单侧肾切除+高糖高脂+STZ复制2型糖尿病肾病(T2DN)模型(术后大鼠死亡2只)，正常对照组行切皮假手术+普通饲料饲养+柠檬酸缓冲液。STZ注射72h后，尾静脉取血，测随机血糖，随机血糖≥16.7mmol/L作为DN大鼠造模成功(其中4只造模未成功)。取造模成功的大鼠随机分为糖肾组(n=20只)和治疗组(n=20只)，各组再分别随机分为6周组、12周组。治疗组于STZ注射后6周和12周尾静脉注射MKAS-ODNs(1mg/kg)，正常对照组及糖肾组尾静脉注射生理盐水(0.16ml/kg)。6周后第4天和12周后第4天收集各组大鼠24小时尿测定24小时尿微量白蛋白(24hUMA)，取血测空腹血糖(FBG)及体重，然后处死大鼠，每组各10只。取肾脏组织，并计算肾重与体重的比值(KW/BW)；用HE染色方法观察肾小管及间质的病理变化；用免疫组化法及实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测肾小管间质中MK及HGF的表达变化。
　　结果：
　　(1)与正常对照组比较，糖肾组、治疗组大鼠在6周、12周末的空腹血糖、24小时尿微量白蛋白及肾重与体重的比值均增高，且差异具有统计学意义(p<0.01)。
　　(2)HE染色结果：正常对照组肾小管结构正常，糖肾组大鼠部分肾小管上皮细胞出现萎缩、脱落、空泡化，基底膜增厚及小管间质纤维化，治疗组较糖肾组稍改善。
　　(3)免疫组织化学分析：正常对照组、糖肾组及治疗组均有MK、HGF的表达，与正常对照组比较，糖肾组及治疗组大鼠6周和12周末肾小管间质MK及HGF表达增多，差异有统计学意义(均P<0.01)。与治疗组相比，糖肾组6周末肾小管间质MK表达增多(P<0.01)，HGF表达量无明显变化(P>0.05)；随着病程延长，12周末糖肾组MK表达增加，HGF表达减少，差异有统计学意义(均P<0。01)。
　　(4)RT-PCR方法结果分析：与免疫组织化学分析结果一致。
　　(5)Pearson相关性分析：糖肾组12周末HGF的表达与MK的表达成负相关(r=-0.525，P<0.01)。
　　结论:
　　1糖肾组大鼠肾组织病理学的改变，表明糖尿病状态下肾组织发生了间质纤维化。
　　2糖肾组肾组织MK表达增加，HGF表达先增加后减少，提示两者可能相互作用共同参与了糖尿病肾病的发病。
　　3MKAS-ODNs可以抑制MK表达及增加HGF的表达，从而减缓糖尿病肾病肾小管间质纤维化的进展。