糖原合成酶激酶-3β和NMDA受体亚单位运输在切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓中的变化及调节

摘要

阿片类药物是临床疼痛治疗的代表性药物，主要用于急、慢性疼痛和癌痛的治疗。它们在镇痛的同时也产生诸多不良反应，其所致的痛觉过敏因为与其治疗初衷相悖，影响了这类药物的临床应用。瑞芬太尼是超短效的μ-阿片受体激动剂，因具有起效快、清除快、无蓄积等特点而被广泛应用于全身麻醉的镇痛，但据文献报告，其产生痛觉过敏的发生率明显高于其他阿片类药物。研究表明NMDA受体功能的改变在瑞芬太尼痛觉过敏的形成过程中发挥了重要的作用，但目前尚无关于NMDA受体亚单位运输与瑞芬太尼痛觉过敏机制关系的报告。糖元合成酶激酶-3(glycogensynthasekinase-3，GSK-3)是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸类激酶，在真核生物中普遍存在。在哺乳动物中包括两个亚型，即GSK-3α和GSK-3β。该酶的作用主要包括调节糖原的合成代谢，参与细胞的分化与增殖等。近年来研究发现，GSK-3影响突触可塑性，并对NMDA受体运输有重要介导作用，即应用GSK-3抑制剂可以抑制NMDA受体在突触后膜的表达。而在瑞芬太尼痛觉过敏模型中，GSK-3的作用尚未见国内外研究报道。
　　本研究以大鼠切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏模型为基础，通过评价大鼠脊髓GSK-3βmRNA表达水平及NMDA受体亚单位运输的变化，并给予δ-阿片受体抑制剂那曲吲哚和GSK-3β抑制剂FDZD-8，通过评价那曲吲哚对切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓GSK-3βmRNA表达水平变化的影响，以及TDZD-8对切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体亚单位运输变化的影响，探讨GSK-3β及NMDA受体亚单位运输的变化及调节在瑞芬太尼痛觉过敏形成机制中的作用。
　　第一部分：切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓GSK-3βmRNA表达水平的变化
　　目的：通过评价切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓GSK-3βmRNA表达水平的变化，探讨GSK-3β在瑞芬太尼引发痛觉过敏中的可能机制。
　　方法：尾静脉置管成功的雄性SD大鼠32只，质量240～260g，随机数字表法分为4组(n=8)，瑞芬太尼组(R组)：经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-1；切口痛组(I组)：建立Brennan切口痛模型，同时经尾静脉置管输注等体积的生理盐水；瑞芬太尼+切口痛组(R+I组)：建立Brennan切口痛模型，同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-1；对照组(C组)：经尾静脉置管输注等体积的生理盐水。瑞芬太尼和生理盐水的输注时间均为60min。于麻醉前24h、麻醉后2、6、24和48h，分别采用Von-Frey丝法和热板法测定机械刺激缩足阈值(PWT)和热刺激缩足潜伏期(PWL)，最后一次测定痛阈后处死大鼠，取脊髓L4-6节段，采用实时定量聚合酶链式反应法测定脊髓GSK-3βmRNA表达水平的变化。
　　结果：R组、I组、R+I组均发生痛觉过敏，且R+I组痛觉过敏的程度高于R组和I组。4组中R+I组GSK-3βmRNA表达水平最高，是C组的4.4倍。
　　结论：术中应用瑞芬太尼麻醉可加重切口痛导致的痛觉过敏；切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓GSK-3βmRNA表达升高，该变化可能参与了切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏形成的机制。
　　第二部分：切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体亚单位运输的变化
　　目的：通过评价切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体亚单位运输的变化，探讨NMDA受体亚单位运输在瑞芬太尼引发痛觉过敏中的可能机制。
　　方法：尾静脉置管成功的雄性SD大鼠32只，质量240～260g，随机数字表法分为4组(n=8)，瑞芬太尼组(R组)：经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-1；切口痛组(I组)：建立Brennan切口痛模型，同时经尾静脉置管输注等体积的生理盐水；瑞芬太尼+切口痛组(R+I组)：建立Brennan切口痛模型，同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-1；对照组(C组)：经尾静脉置管输注等体积的生理盐水。瑞芬太尼和生理盐水的输注时间均为60min。于麻醉前24h、麻醉后2、6、24和48h，分别采用Von-Frey丝法和热板法测定机械刺激缩足阈值(PWT)和热刺激缩足潜伏期(PWL)，最后一次测定痛阈后处死大鼠，取脊髓L4-6节段，采用westernblot法测定脊髓细胞膜(s)及胞浆内(i)NMDA受体NR1、NR2A及NR2B亚单位的表达，并计算sNR1/iNR1、sNR2A/iNR2A及sNR2B/iNR2B比值。
　　结果：与C组比较，I组、R组和R+I组PWT降低，PWL缩短，细胞膜NMDA受体NR1和NR2B亚单位表达上调，胞浆内NMDA受体。NR1和NR2B亚单位表达下调，sNR1/iNR1及sNR2B/iNR2B比值增加(P<0.05)。与R组和I组比较，R+I组PWT降低，PWL缩短，细胞膜NMDA受体NR1和NR2B亚单位表达上调，胞浆内NMDA受体NR1和NR2B亚单位表达下调，sNR1/iNR1及sNR2B/iNR2B比值增加(P<0.05)。各组细胞膜及胞浆内NMDA受体NR2A亚单位表达及sNR2A/iNR2A比值无显著性差异(P>0.05)。
　　结论：术中应用瑞芬太尼麻醉可加重切口痛导致的痛觉过敏；切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体NR1及NR2B亚单位从胞浆内向细胞膜的运输增加，该变化可能参与了切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏形成的机制。
　　第三部分：GSK-3β抑制剂TDZD-8对切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体亚单位运输变化的影响
　　目的：评价GSK-3β对切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体NR1及NR2B亚单位运输变化的影响。
　　方法：尾静脉置管成功的雄性SD大鼠24只，体重240-260g，采用随机数字表法，将大鼠随机分为3组(n=8)：对照组(C组)静脉推注二甲基亚砜(DMSO)(2ml/kg)，静脉输注与瑞芬太尼等容量生理盐水60min；瑞芬太尼+切口痛组(R+I组)静脉推注DMSO(2ml/kg)，制备切口痛模型，模型制备前即刻开始静脉输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-160min；GSK-3β抑制剂组(TDZD-8组)静脉推注TDZD-8(1mg/kg)，制备切口痛模型，模型制备前即刻开始静脉输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-160min。于静脉输注瑞芬太尼前24h、静脉给药后2、6、24和48h(T0～4)时测定机械刺激缩足阈值(PWT)和热刺激缩足潜伏期(PWL)，最后一次测定痛阈后处死大鼠，取脊髓L4-6节段，采用westernblot法测定脊髓细胞膜(s)及胞浆内(i)NMDA受体NR1及NR2B亚单位的表达，并计算sNR1/iNR1及sNR2B/iNR2B比值。
　　结果：与C组比较，R+I组和TDZD-8组PWT降低，PWL缩短，sNR1和sNR2B表达增加，iNR1和iNR2B表达减少，sNR1/iNR1及sNR2B/iNR2B比值增加(P<0.05)。与R+I组比较，TDZD-8组PWT升高，PWL延长，sNR1和sNR2B表达减少，iNR1和iNR2B表达增加，sNR1/iNR1及sNR2B/iNR2B比值减小(P<0.05)。
　　结论：GSK-3β参与调节切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体NR1及NR2B亚单位运输。
　　第四部分：δ-阿片受体抑制剂那曲吲哚对切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓GSK-3βmRNA表达水平变化的影响
　　目的评价δ-阿片受体对切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓GSK-3βmRNA表达水平变化的影响。
　　方法尾静脉置管成功的雄性SD大鼠24只，体重240～260g，采用随机数字表法，将大鼠随机分为3组(n=8)：对照组(C组)腹腔内注射生理盐水，静脉输注与瑞芬太尼等容量生理盐水60min；瑞芬太尼+切口痛组(R+I组)腹腔内注射生理盐水，制备切口痛模型，模型制备前即刻开始静脉输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-160min；δ-阿片受体抑制剂组(naltrindole组)腹腔内注射那曲吲哚(0.1mg/kg)，制备切口痛模型，模型制备前即刻开始静脉输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-160min。于静脉输注瑞芬太尼前24h、静脉给药后2、6、24和48h(T0～4)时测定机械刺激缩足阈值(PWT)和热刺激缩足潜伏期(PWL)，最后一次测定痛阈后处死大鼠，取脊髓L4-6节段，采用实时定量PCR法测定脊髓GSK-3βmRNA的表达。
　　结果与C组比较，R+I组和naltrindole组PWT降低，PWL缩短，大鼠脊髓GSK-3βmRNA表达增加(P<0.05)。与R+I组比较，naltrindole组PWT升高，PWL延长，大鼠脊髓GSK-3βmRNA表达减少(P<0.05)。
　　结论δ-阿片受体参与调节切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓GSK-3βmRNA表达水平的变化。