糖原合成酶激酶-3β调控NMDA及AMPA受体在瑞芬太尼痛觉过敏中的机制研究

摘要

阿片类药物是临床疼痛治疗的代表性药物，主要用于急、慢性疼痛和癌痛的治疗。应用阿片药物引起镇痛作用之外的多种不良反应，阿片类药物诱发痛觉过敏就是其中之一，很大程度上限制了阿片类药物的临床应用。瑞芬太尼是一种超短效μ-阿片受体激动剂，其特点有无蓄积、清除快、起效快被广泛应用于全身麻醉的术中镇痛，查阅文献发现瑞芬太尼诱发痛觉过敏的出现时间短，且发生率高于其他阿片类药物。最近临床研究和基础研究表明给予氯氨酮(NMDA受体抑制剂)可以抑制瑞芬太尼痛觉过敏的发生，提示NMDA受体参与瑞芬太尼痛觉过敏的形成，但是应用氯胺酮可产生嗜睡、头晕、镇静和幻觉等副作用，应用上受到一定限制。因此明确瑞芬太尼痛觉过敏的分子机制和寻找新的用药靶点具有重要临床意义。
　　糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)是一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，在真核生物细胞中普遍存在。GSK-3有两个亚型——GSK-3α和GSK-3β。GSK-3的主要功能是参与糖原的分解合成，调控神经元生长、增殖和分化等。近年来研究发现，GSK-3β影响突触可塑性，并对神经元NMDA受体和AMPA受体的运输和功能有重要调控作用。由此我们推测GSK-3β调控NMDA受体和AMPA受体的运输和功能可能是瑞芬太尼痛觉过敏的发生机制。
　　本研究采用大鼠切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏模型和体外脊髓片瑞芬太尼孵育模型，研究GSK-3β在瑞芬太尼诱发痛觉过敏大鼠脊髓背角NMDA受体和AMPA受体不同亚基表达和功能的变化，对瑞芬太尼痛觉过敏的分子机制进行深入探索，为寻找防治阿片类药物诱发痛觉过敏方法提供新的作用靶点。
　　第一部分:切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓GSK-3β蛋白活性的变化
　　目的：通过检测大鼠脊髓背角GSK-3β蛋白活性的改变，探讨GSK-3β在切口痛-瑞芬太尼引发痛觉过敏中的潜在机制。
　　方法：雄性SD大鼠32只，经尾静脉穿刺置管，体重240～260g，随机数字表法分为4组(n=8):对照组（C组）:经尾静脉置管输注生理盐水，0.1ml·kg-1·min-1;切口痛组（I组）:建立Brennan切口痛模型，同时经尾静脉置管输注等量生理盐水，0.1ml· kg-1·min-1;瑞芬太尼组（R组）:经尾静脉置管输注瑞芬太尼，1.0μg·kg-1·min-1;瑞芬太尼+切口痛组（RI组）:建立Brennan切口痛模型，同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼，1.0μg·kg-1·min-1:生理盐水和瑞芬太尼的输注时间均为60min。于输注前1d、输注后2h、6h、1d、2d、3d、5d和7d，分别采用电子Von-Freyfilaments法测定机械刺激缩爪阈值(PWT)，热板法测定热刺激缩爪潜伏期(PWL)，输注后2d处死大鼠，取脊髓L4-6节段，采用Western Blot法测定大鼠腰段脊髓背角磷酸化丝氨酸9-GSK-3β(pSer9-GSK-3β)，磷酸化酪氨酸216-GSK-3β(pTyr216-GSK-3β)和总GSK-3β的蛋白表达在各组的变化。
　　结果：与C组相比，I组、R组、RI组均发生热痛敏和机械痛敏。RI组热痛敏和机械痛敏的程度高于I和R组。与C组相比，R组、I组、RI组均发生pTyr216-GSK-3β表达水平升高，且RI组的升高程度高于R组和I组。与C组相比，R组、I组、RI组均发生pSer9-GSK-3β表达降低，且RI组的降低程度高于R组和I组。GSK-3β的总蛋白表达水平在各组无统计学差异。
　　结论：瑞芬太尼术中输注可加重切口痛诱发的痛觉过敏;切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏可增加大鼠脊髓背角GSK-3β活性，这是通过升高GSK-3β的Tyr216磷酸化和降低Ser9的磷酸化水平引起的，这可能是切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏的潜在机制之一。
　　第二部分:GSK-3β对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体运输和功能的影响
　　实验一:GSK-3β对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体NR1、NR2A和NR2B亚单位运输的影响
　　目的：通过检测GSK-3β抑制剂对大鼠脊髓背角NMDA受体亚单位运输的影响，探讨GSK-3β参与NMDA受体亚单位表达和运输在瑞芬太尼诱发痛觉过敏中的作用。
　　方法：雄性SD大鼠40只，经尾静脉置管，体重240～260g，随机数字表法分为5组(n=8):对照组（C组）:经尾静脉置管输注生理盐水，0.1 ml·kg-1· min-1;甘氨酸组（G组）:经尾静脉置管输注甘氨酸，15μg·kg-1·min-1;瑞芬太尼组(R组):经尾静脉置管输注瑞芬太尼，1.0μg·kg-1· min-1;瑞芬太尼+GSK-3β抑制剂TDZD组（RT组）:经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1和TDZD1μg·kg-1; TDZD组（T组）:经尾静脉置管输注，TDZD1μg·kg-1;输注时间均为60min。于输注前24 h、输注后2h、6h、24 h和48 h，分别采用热板法测定热刺激缩爪潜伏期(PWL)，电子Von-Frey Filaments法测定机械刺激缩爪阈值(PWT)，输注后48 h处死大鼠，取脊髓L4-6节段，采用Western Blot法分别测定脊髓背角NMDA受体NR1、NR2A及NR2B亚单位的膜蛋白和总蛋白表达水平。
　　结果与C组比较，R组热痛敏和机械痛敏增强，NMDA受体NR1和NR2B亚单位细胞膜蛋白表达上调，NMDA受体NR1和NR2B亚单位总蛋白表达上调(P＜0.05)。与R组比较，T组热痛敏和机械痛敏降低，NMDA受体NR1和NR2B亚单位细胞膜蛋白表达下调，NMDA受体NR1和NR2B亚单位总蛋白表达下调，(P＜0.05)。各组NMDA受体NR2A亚单位的细胞膜及总蛋白表达均无显著性差异(P＞0.05)。
　　结论：瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角NMDA受体NR1及NR2B亚单位向细胞膜的运输和表达增加，GSK-3β抑制剂TDZD可以降低瑞芬太尼输注所引起的热痛敏和机械痛敏，降低NR1和NR2B的运输和表达。提示瑞芬太尼可能通过增强GSK-3β活性来增强NR1和NR2B的运输和表达。
　　实验二:GSK-3β对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体功能的影响
　　目的：探讨GSK-3β在瑞芬太尼诱发大鼠脊髓背角神经元NMDA受体微小兴奋性突触后膜电流（miniature excitatory postsynaptic currents，mEPSCs）中的作用。
　　方法：取出生14～18天的SD大鼠24只，体重50～60g，随机分为4组(n=8):对照组（C组）:取腰段脊髓(L1～S1)，制备脊髓片，置入人工脑脊液中孵育:甘氨酸组（G组）:制备脊髓切片，置入含甘氨酸（浓度0.24μmol·L-1）的人工脑脊液中孵育;瑞芬太尼组（R组）:制备脊髓切片，置入含瑞芬太尼（浓度为4 nmol·L-1）的人工脑脊液中孵育;瑞芬太尼+GSK-3β抑制剂TDZD-8组(RT组):制备脊髓切片，置入含瑞芬太尼和TDZD-8(浓度分别为4 nmol·L-1和10μmol·L-1)的人工脑脊液中孵育。各组孵育60 min后应用全细胞膜片钳技术记录脊髓背角神经元NMDA受体介导的mEPSCs的振幅和频率。
　　结果：与C组比较，R组mEPSCs的振幅和频率升高(P＜0.01)，G组和RT组差异无统计学意义(P＞0.05);与R组比较，RT组振幅和频率降低(P＜0.01)。
　　结论：瑞芬太尼孵育增强后可增强NMDA受体的功能，GSK-3β抑制剂TDZD可以抑制瑞芬太尼孵育对NMDA受体功能的增强作用，说明瑞芬太尼孵育后可引起GSK-3β活性增强，进而增强NMDA受体功能。
　　第三部分:GSK-3β对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体运输和功能的影响
　　实验一:GSK-3β对切口痛一瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体GluR1和GluR2亚单位运输的影响
　　目的：通过评价切口痛，瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体亚单位运输的变化，探讨GSK-3β调控AMPA受体亚单位运输在瑞芬太尼引发痛觉过敏中的机制。
　　方法：健康雄性SD大鼠，尾静脉置管，体重240～260g，随机数字表法分6组(n=8):对照组（C组）:经尾静脉置管输注生理盐水，0.1 ml·kg-1·min-1;瑞芬太尼组（R组）:经尾静脉置管输注瑞芬太尼，1.0μg·kg-1· min-1;切口痛组(I组):建立Brenman切口痛模型，同时经尾静脉置管输注等量生理盐水，0.1ml·kg-1·min-1;瑞芬太尼+切口痛组（RI组）:建立Brennan切口痛模型，同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼，1.0μg·kg-1·min-1;瑞芬太尼+GSK-3β抑制剂LiCl组（LiCl组）:建立Brennan切口痛模型，同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.0μg·kg-

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓GSK-3 β蛋白活性的变化

1．1 对象和方法

1．1．1 实验材料

1．1．2 实验方法

1．2 结果

1．2．1 瑞芬太尼输注后不同时点大鼠热板缩爪潜伏期(PWL)和机械缩爪阈值(PWT)的变化

1．2．2 大鼠腰段脊髓磷酸化GSK-3 β和总GSK-3 β蛋白表达分析

1．3 讨论

1．3．1 瑞芬太尼可引发痛觉过敏

1．3．2 动物模型的建立

1．3．3 给药剂量的选择

1．3．4 疼痛行为学结果讨论

1．3．5 GSK-3 β与瑞芬太尼痛觉过敏

1．4 小结

二、GSK-3 β抑制剂对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体运输和功能的影响

2．1 实验一、GSK-3 β对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体NR1、NR2A和NR2B亚单位运输的影响

2．1．1 对象和方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

2．1．4 小结

2．2 实验二、GSK-3 β抑制剂对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体功能的影响

2．2．1 对象和方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

2．2．4 小结

三、GSK-3β抑制剂对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体运输和功能的影响

3．1 实验一、GSK-3β抑制剂对切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体GluR1和GluR2亚单位运输的影响

3．1．1 对象和方法

3．1．2 结果

3．1．3 讨论

3．1．4 小结

3．2 实验二、GSK-3 β抑制剂对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体功能的影响

3．2．1 对象和方法

3．2．2 结果

3．2．3 讨论

3．2．4 小结

3．3 实验三、GSK-3 β调控AMPA受体运输的相关机制

3．3．1 对象和方法

3．3．2 结果

3．3．3 讨论

3．3．4 小结

全文结论

论文创新点

不足之处和展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 δ-阿片受体抑制阿片诱发痛觉过敏的研究进展

致谢