hBD3在牙周炎致病机制方面的初步研究

摘要

目的:
　　 通过组织块法培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast，HGFs)，观察HGFs体外培养的生物学特性，探讨人类β-防御素3(Human Beta-Defensins3，hBD3)对HGFs增殖情况的影响，通过分析hBD3及与Pg-LPS联合作用对HGFs分泌PGE2和MMP-1的情况，初步探讨此过程中可能涉及到的TLR，MAPK，PI3K，NF-κB各级信号通路。研究hBD3在牙周炎致病机制方面的作用。
　　 方法:
　　 1.组织块培养法体外培养人牙龈成纤维细胞，倒置相差显微镜观察细胞形态，免疫组织化学方法鉴定细胞来源，3-6代细胞用于实验。
　　 2.四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl terazolium，MTT)动态检测人牙龈成纤维细胞在不同浓度hBD3干预下增殖情况。
　　 3.酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)检测不同浓度hBD3不同时间点HGFs上清液中PGE2和MMP-1的含量，以及加入Pg-LPS以及不同信号抑制剂产生PGE2和MMP-1的量。
　　 4.特定浓度hBD3，分别与等体积NF-κB信号抑制剂SN-50，50UM; PI3K信号抑制剂LY294002，20UM; JNK信号抑制剂SP600125，20UM; P38信号抑制剂SB203580，20UM; ERK信号抑制剂PD98059，10UM，分析hBD3刺激HGFs分泌PGE2和MMP-1涉及的信号通路。
　　 结果:
　　 1.采用组织块培养法能够在体外成功培养出HGFs。倒置相差显微镜下观察细胞胞核均染，呈长梭形，并围绕组织块呈放射状排列。抗角蛋白染色阴性，抗波形丝蛋白染色阳性，可见细胞来源于中胚层，结合取材部位证实所培养细胞为HGFs。
　　 2.MTT检测结果显示，10ug/ml的hBD3分别与对照组和0.3ug/ml组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05);10ug/ml的hBD3对HGFs的增殖作用最显著。第3天细胞进入对数生长期，第5-6天细胞生长减缓，第7天逐渐进入平台期，细胞生长曲线大致呈S形。
　　 3.ELISA法检测显示，1ug/ml hBD3与对照组及10ug/ml hBD3组相比刺激HGFs产生PGE2差异均有统计学意义(P＜0.05)，且随着时间延长，PGE2的分泌量高于其他组;而对于MMP-1，hBD3浓度为1ug/ml时，与对照组及0.3ug/mlhBD3浓度组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，且随着时间延长，MMP-1的分泌量高于其他组。
　　 4.hBD3组与Pg-LPS组，Pg-LPS+hBD3组比较，在刺激HGFs产生PGE2和MMP-1的过程中Pg-LPS作用最强，hBD3组最弱，且三组之间均有显著性差异。
　　 5.hBD3联合多种信号通路(TLR，MAPK，PI3K，NF-κB)抑制剂，刺激HGFs产生PGE2和MMP-1的量均下降，且减少的量与信号抑制剂种类相关。hBD3刺激HGFs产生PGE2的过程可被SP600125，SC-3060特异性阻断;产生MMP-1过程中可被SB203580，PD98059，SC-3060，anti-TLR2抗体特性性阻断。
　　 结论:
　　 1.组织块培养法可成功培育出HGFs;细胞生长代谢旺盛，分裂较快，满足实验要求，培养过程中无菌操作，避免污染，是确保细胞培养成功的关键。
　　 2.一定浓度的hBD3能促进HGFs增殖及其分泌PGE2和MMP-1，实验结果显示1ug/ml为hBD3的最佳效应浓度，最佳显效时间为12h。
　　 3.hBD3，Pg-LPS，hBD3+Pg-LPS三者作用HGFs产生PGE2，MMP-1的结果说明:Pg-LPS刺激产生PGE2，MMP-1作用最强，可见Pg-LPS对牙周组织具有较高的毒性，在牙周病的发生发展中起着重要作用;hBD3在致炎方面与Pg-LPS相比作用较弱;hBD3与Pg-LPS联合作用时，hBD3抵消部分Pg-LPS产生PGE2，MMP-1的作用，使得Pg-LPS致炎作用减弱。
　　 4.hBD3刺激HGFs产生PGE2是通过MAPK中的JNK通路和NF-κB通路;hBD3刺激HGFs产生MMP-1过程中涉及了TLR2和MAPK中的P38、ERK信号通路以及NF-κB通路。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、不同浓度的hBD3对HGFs增殖的影响

1．1 对象和方法

1．1．1 实验仪器与设备

1．1．2 试剂

1．1．3 主要试剂配制

1．1．4 实验方法

1．1．5 统计学处理

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 小结

二、hBD3刺激HGFs分泌PGE2和MMP-1情况

2．1 对象和方法

2．1．1 实验仪器与设备

2．1．2 试剂

2．1．3 主要试剂配制

2．1．4 实验方法

2．1．5 统计学处理

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

三、hBD3联合Pg-LPS刺激HGFs分泌PGE2和MMP-1情况

3．1 对象和方法

3．1．1 实验仪器与设备

3．1．2 试剂

3．1．3 主要试剂配制

3．1．4 实验方法

3．1．5 统计学处理

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

四、hBD3刺激HGFs分泌PGE2和MMP-1涉及信号通路

4．1 对象和方法

4．1．1 实验仪器与设备

4．1．2 试剂

4．1．3 实验分组

4．1．4 实验方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 人类β-防御素3在牙周组织免疫防御中的作用

致谢