HIV-1病毒蛋白R诱导胶质瘤细胞系G2期阻滞和凋亡的相关研究

摘要

目的和内容：
　　 胶质瘤是颅内最常见肿瘤，约占颅内原发性肿瘤的40％～50％，目前其治疗方式主要是以手术切除为主并辅以必要的放疗和化疗，虽然近年来手术技术和放化疗治疗取得一定进步，但因胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤的高侵袭性，通常难以完全手术切除，术后复发率极高，故肿瘤患者的预后并未发生明显改善，因此探索新的行之有效的治疗方法以延长恶性胶质瘤患者的生存期和改善患者预后势在必行。近年来，关于肿瘤发生发展的相关基础研究取得显著进展，研究肿瘤发生的分子机制，并探索针对肿瘤中分子生物学变化的靶向治疗，有望成为治愈恶性肿瘤新方法。
　　 HIV-1病毒蛋白R(Vpr)是由96个氨基酸组成的相对分子质量为14000的小分子蛋白，已有研究报道，Vpr能通过与细胞中众多分子相互作用而抑制肿瘤细胞的增殖，其机制主要包括:1）Vpr能通过非依赖DNA损伤的途径诱导肿瘤细胞周期停滞在G2期，2）Vpr能通过依赖或非依赖p53的途径诱导肿瘤细胞凋亡。我课题组的前期研究发现，Vpr能诱导胶质瘤细胞G2期阻滞和凋亡，能增敏作用于G2期的化疗药物卡莫司汀(BCNU)和替尼泊苷（VM-26）对胶质瘤细胞的杀伤作用，体外实验也发现Vpr能明显抑制胶质瘤的成瘤。目前，研究发现Vpr能诱导包括胶质瘤在内的众多肿瘤G2期阻滞和凋亡，然而对其具体作用机制尚存争议，我课题组对Vpr诱导胶质瘤细胞周期阻滞和凋亡的具体机制进行了深入研究，以探索Vpr在抑制胶质瘤增殖中的作用靶点，为临床治疗提供新思路。
　　 本课题研究分为以下三部分:
　　 方法：
　　 第一部分，携带Vpr基因的重组腺病毒载体（rAd5-Vpr）的扩增，PCR及基因序列测定鉴定，并采用微量全细胞病变法测定病毒滴度。
　　 第二部分，利用第一部分扩增的rAd5-Vpr，按MOI=100转染胶质瘤细胞U87，采用双向电泳和蛋白芯片技术对转染rAd5-Vpr前后胶质瘤细胞蛋白表达的差异进行分析，以探求Vpr引起胶质瘤细胞周期阻滞和凋亡的具体作用靶点。
　　 第三部分，我课题组前期研究发现，rAd5-Vpr转染U251细胞后行基因芯片分析发现编码转化生长因子受体Ⅲ(Tβ RⅢ)的基因表达升高。已有报道称Tβ RⅢ在多种肿瘤中表达缺失，并参与肿瘤发生过程，为探讨Vpr抑制胶质瘤增殖过程中是否涉及Tβ RⅢ，我们采用免疫组织化学染色法检测了Tβ RⅢ在40例胶质瘤中的表达情况。并用Western blot检测了18例胶质瘤（高低级别各9例）中Tβ RⅢ的表达，进一步验证免疫组化结果。
　　 结果：rAd5-Vpr扩增后测定滴度为5×108PFU/mL，按MOI=100转染胶质瘤细胞，满足本实验要求。胶质瘤细胞转染rAd5-Vpr后蛋白质组学分析提示:双向电泳结合质谱分析检测出转染rAd5-Vpr后U87MG细胞较转染前8种蛋白上调表达，9种蛋白下调表达。凋亡抗体芯片检测出转染前后，13种凋亡相关蛋白上调表达，2种蛋白下调表达。Westernblot进一步验证了转染病毒后U87MG细胞中增殖相关蛋白2G4(PA2G4)的低表达和p53的高表达。
　　 免疫组化检测的40例胶质瘤中Tβ RⅢ的表达情况，低级别胶质瘤阳性表达率为84.6％(11/13)，高级别胶质瘤阳性表达率为48.1％(13/27)，高低级别间差异有统计学意义(P＜0.05)，Western blot检测结果与免疫组化一致。
　　 结论：
　　 1、Vpr能与胶质瘤U87MG细胞中涉及DNA损伤、细胞增殖代谢或有丝分裂相关蛋白等相互作用从而导致肿瘤细胞的周期停滞和凋亡。
　　 2、Vpr通过内源性和外源性凋亡途径诱导U87MG细胞的凋亡。
　　 3、Vpr可能通过抑制Ebp1的表达而间接上调p53的表达从而抑制U87MG的增殖。
　　 4、Vpr在基因和蛋白水平诱导胶质瘤细胞系U251中Tβ RⅢ的表达。
　　 5、高级别胶质瘤中Tβ RⅢ表达降低，提示Tβ RⅢ可能参与胶质瘤恶变过程，促进肿瘤的侵袭和迁移。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、rAd5-Vpr的扩增、鉴定和病毒滴度测定

1．1 对象和方法

1．1．1 主要材料和试剂

1．1．2 主要仪器设备

1．1．3 重组腺病毒在HEK293细胞中的扩增

1．1．4 病毒DNA的提取

1．1．5 Vpr基因PCR和基因测序鉴定

1．1．6 病毒滴度的测定

1．2 结果

1．2．1 重组腺病毒rAd5-Vpr的PCR鉴定

1．2．2 重组腺病毒rAd5-Vpr的基因测序

1．2．3 扩增病毒的滴度测定

1．2．4 扩增的病毒转染胶质瘤细胞

1．3 讨论

1．4 小结

二、tAd5-Vpr转染胶质瘤细胞系的蛋白质组学研究

2．1 对象和方法

2．1．1 对象和主要试剂

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 细胞培养病毒转染

2．1．4 双向电泳蛋白提取

2．1．5 双向电泳

2．1．6 质谱分析

2．1．7 凋亡蛋白芯片分析

2．1．8 Western Blot

2．2 结果

2．2．1 转染rAd5-Vpr对胶质瘤细胞系U87MG蛋白质表达的影响

2．2．2 Vpr通过内源性和外源性凋亡途径诱导胶质瘤细胞U87MG的凋亡

2．2．3 Vpr可能通过上调Ebp1蛋白进而调控p53的表达

2．3 讨论

2．4 小结

三、Vpr上调胶质瘤中Ⅲ型转化生长因子-β受体表达的研究

3．1 对象和方法

3．1．1 对象

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 方法

3．2 结果

3．2．1 Vpr对胶质瘤细胞系U251中TβRⅢ表达的影响

3．2．2 免疫组化检测TβRⅢ在40例人脑胶质瘤组织中的表达

3．2．3 Western Blot检测TβRⅢ在18例肿瘤组织中的表达

3．3 讨论

3．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 TβRⅢ负性调控肿瘤发生的研究进展

致谢