PsD007-PDT对人喉部细胞的杀伤作用

摘要

目的:
　　 喉癌(LaryngealCarcinoma)是来源于喉粘膜上皮组织的恶性肿瘤，虽然近几十年来传统的治疗方式如手术、放疗和化疗等有了很大的改进，但手术对喉功能的破坏以及放、化疗的严重副作用使以上治疗方式受到极大限制。对于晚期和复发喉癌，国内外都相继开展了多种多样的生物治疗，希望能够减轻患者痛苦。
　　 光动力疗法(PhotodynamicTherapy,PDT)是一种激光医学领域的新方法，已被多个国家批准可用于某些肿瘤的治疗。影响PDT效果的关键因素不仅体现在光敏剂在肿瘤组织或细胞的选择性积聚和特定光照波长及强度的选择上，而且还与光敏剂进入的亚细胞结构和积聚程度有关。因此探索PDT治疗的合适条件，能相对特异性地杀伤肿瘤细胞、减少对健康组织的损害、降低并发症以及毒副反应等，使其成为一项非常有前途的肿瘤治疗方法。本文将通过研究癌光啉(PsD007)诱导的光动力疗法在体内外对人喉癌细胞Hep2的杀伤作用，初步探索其杀伤机制。
　　 方法:
　　 1、体外实验
　　 体外培养Hep2细胞，观察不同时间光敏剂在肿瘤细胞中的孵育特性;MTT法测定在不同光敏剂浓度(3.125-100μg/mL)、光照剂量(1.2-4.8J/cm2)以及三种抗氧化剂的作用下PDT杀伤效果;共聚焦显微镜观察光敏剂的亚细胞定位;AnnexinV/PI双染法检测不同剂量PDT处理后细胞凋亡率;DCFH-DA探针检测PDT处理后2H内细胞的活性氧(ROS)产量。
　　 2、在体实验
　　 建立Balb/c裸鼠喉癌模型，肿瘤组织长至0.5-1cm3时进行PDT处理。其中PsD007的浓度为10mg/kg，光源为635nm的半导体激光器，激光功率密度分别为100、200和400mW/cm2。动物随机分为对照组（空白对照组、单纯光敏剂组、单纯照光组）和光动力作用组（30J/cm2组、60J/cm2组、120J/cm2组、240J/cm2组和480J/cm2组）。PDT后观察并记录肿瘤生长情况，画出肿瘤生长曲线和体重变化曲线，第50天处死裸鼠取肿瘤组织，HE切片观察;取PDT作用后
　　 1、24和48h的肿瘤组织，HE染色观察其形态。
　　 结果:
　　 1、PDT对人喉癌细胞的杀伤作用高于对照组(P＜0.05)，MTT结果显示PDT对Hep2的杀伤效果可高达85.4％，光敏剂浓度和光照能量密度都与细胞死亡率呈正相关，在一定范围内，随着光敏剂浓度的增加和光照能量的增大，光动力作用对细胞的相对抑制率逐渐增大，调整光敏剂浓度和光照能量密度，可以优化光动力处理效果;PDT4h后凋亡率可达49.5％（能量密度为1.2J/cm2）和70.2％（能量密度为4.8J/cm2）;三种抗氧化剂均能不同程度拮抗PDT对细胞的杀伤效应，以叠氮钠效果最好(P＜0.05);光敏剂在细胞内主要定位在线粒体;PDT组细胞内ROS含量显著提高，是单纯对照组的2.08倍，PDT后2h更是升至对照组的2.71倍。
　　 2、在体实验中，PDT组裸鼠的肿瘤生长缓慢，且120J/cm2组和480J/cm2组荷瘤裸鼠在治疗16天后全部治愈;PDT组裸鼠的体重明显比对照组重(P＜0.05)，生存质量高。HE切片结果显示PDT作用后肿瘤组织发生明显的坏死、血管水肿、淋巴细胞浸润和纤维组织增生等急性损伤的特征。
　　 结论:
　　 体外和在体实验均显示PsD007-PDT对Hep2细胞有明显的抑制作用。其对细胞的抑制率与光敏剂浓度、激光能量密度、激光功率密度和抗氧化剂有密切关系。其诱导的凋亡机制以线粒体凋亡为主，凋亡发生可能是通过产生活性氧诱发线粒体凋亡途径引起的，同时也伴随着其他死亡方式。体外实验的几组治疗参数中，以PDT120J/cm2组(激光功率密度=100mW/cm2，能量密度=120J/cm2)实验效果最好。本实验初步证实了PDT在喉癌治疗中的可行性以及PDT用于体内治疗的相对安全性，为光动力疗法的临床研究提供了新的科学依据和理论基础，将有助于拓展PDT在临床治疗领域中的应用。

目录

声明

摘要

缩略语说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、PsD007-PDT对人喉癌细胞的杀伤效果

1．1 材料和方法

1．1．1 实验细胞

1．1．2 实验试剂

1．1．3 实验设备

1．1．4 实验方法

1．2 结果

1．2．1 光敏剂的孵育时间

1．2．2 光敏剂的亚细胞定位

1．2．3 MTT法检测细胞活性

1．2．4 细胞凋亡的检测

1．2．5 抗氧化剂对PsD007-PDT的抑制作用

1．2．6 细胞ROS的检测

1．3 讨论

1．4 小结

二、PsD007-PDT对人喉癌裸鼠模型的治疗效果

2．1 材料和方法

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验设备

2．1．4 实验方法

2．2 结果

2．2．1 裸鼠体重变化

2．2．2 裸鼠肿瘤生长大小

2．2．3 PDT对人喉癌裸鼠移植瘤治愈率的影响

2．2．4 组织病理学结果

2．3 讨论

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 光动力疗法对肿瘤细胞的杀伤机制研究进展

致谢