他克莫司对重型再生障碍性贫血患者效应T细胞抑制作用的研究

摘要

目的:
　　 体外研究他克莫司(FK506)对重型再生障碍性贫血(SAA)患者骨髓CD8+HLA-DR+T细胞的抑制作用，SAA患者效应T细胞功能与临床的相关性，进一步探讨SAA的免疫发病机制。
　　 方法:
　　 取16例SAA患者骨髓10ml，经淋巴细胞分离液，分离提取单个核细胞。
　　 经免疫磁珠分选16例SAA患者骨髓CD8+HLA-DR+T细胞，流式细胞术检测分选纯度在85％以上。计数分选的阳性细胞，以2×105/ml细胞浓度置于96孔板中，分IL-2组（接种6孔）、FK506组（接种7孔），孵育24小时后分别加入不同浓度IL-2、FK506，培养48小时后加入MTT混匀孵育4小时，离心后吸出培养液，每孔各加入二甲基亚砜(DMSO)摇匀后，酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度值(A490nm)测培养孔细胞增殖。
　　 用淋巴分离液分离上述SAA患者骨髓T淋巴细胞，将上述所得单个核细胞后以5×105/ml细胞浓度接种于含RPMI-1640培养基的24孔板中，设空白对照组、IL-2组、FK506组、FK506+CsA组，共培养18小时后加入佛波酯(PMA)等活化4小时，用流式细胞仪测CD8+HLA-DR+T细胞内TNF-β蛋白表达水平;并进一步分析TNF-β表达量与外周血象及CD4+/CD8+T细胞比例的关系。
　　 结果:
　　 1.SAA患者效应细胞CD8+HLA-DR+细胞纯度均在85％以上。
　　 2.随着IL-2浓度的增加，IL-2组细胞出现不同程度的增殖，以IL-2浓度为20、200、2000u/ml组增殖明显，与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。并且FK506可以抑制以上三种浓度IL-2的促增殖作用，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3.CD8+HLA-DR+T细胞TNF-β平均表达量在空白组、IL-2组、FK506组、FK506+CsA组分别为:(66.61±16.2)％、（73.36±16.73）％、(47.78±20.09)％、（42.23±21.35）％，IL-2组明显高于空白对照组，FK506组和FK506+CsA组明显低于空白对照组，而FK506+CsA组与FK506组差异无统计学意义。
　　 4.空白组TNF-β表达量与患者临床血象中网织红细胞百分比、淋巴细胞比例及CD4+T细胞与CD8+T细胞比例有显著的相关关系，相关系数r分别为:-0.86、0.77、-0.9。
　　 结论:
　　 1.IL-2能促进SAA患者CD8+HLA-DR+T细胞增殖，FK506能抑制此增殖作用。
　　 2.IL-2能促进CD8+HLA-DR+T细胞分泌高水平的TNF-β，FK506能抑制其分泌;FK506联合CsA对CD8+HLA-DR+T细胞抑制作用与单用FK506作用相当。
　　 3.TNF-β表达量与CD4+/CD8+T细胞比例呈负相关，与患者外周血淋巴细胞比例呈正相关，与患者网织红细胞百分比呈负相关，再次提示TNF-β在CD8+T细胞对SAA患者骨髓的损伤中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1 研究对象

2 主要试剂与仪器

3 方法

3．1 从新鲜外周血分离单个核细胞

3．2 磁珠分选效应细胞

3．3 细胞培养

3．4 TNF-?水平检测

3．5 TNF-?表达量与SAA患者临床资料相关性分析

3．6 统计学处理

结果

1 流式细胞仪检测分选细胞

2 细胞增殖测定

3 TNF-?蛋白表达水平

4 TNF表达量与SAA患者临床资料相关性分析

讨论

小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 重型再生障碍性贫血预后因素研究进展

致谢