琥珀酸半醛脱氢酶缺陷病基因突变研究

摘要

琥珀酸半醛脱氢酶缺陷病(succinic semialdehyde dehydrogenase defeciency,SSADH defeciency)是一种少见的常染色体隐性遗传代谢异常性疾病，由SSADH缺陷引起。此病主要在婴幼儿起病，临床表现多样化，最多见于神经系统表现异常，主要包括发育延迟（其中动作语言发育落后最为突出）、轻度至中度智力障碍、肌张力低下、行为异常（如孤独症样表现，年长儿往往存在焦虑、幻觉）、癫痫、运动过度、共济失调和反射减弱或消失等。SSADH编码基因为ALDH5A1，定位于6号染色体短臂2区2带。目前基因型与临床表型相关性报道较少，国内尚无ALDH5A1基因突变的相关报道。
　　目的:
　　对SSADH缺陷病患儿及家系成员的ALDH5A1基因进行突变分析，明确患儿基因突变位点及家系中突变位点的携带情况;为SSADH缺陷病患者家系的遗传咨询和产前诊断提供实验方法和新的诊断依据，阻止疾病在家系中的蔓延;提供研究群体的ALDH5A1基因突变数据，探讨中国人群ALDH5A1基因突变种类及特点，丰富中国人群SSADH缺陷病基因突变数据库资料;也为新生儿筛查项目的遴选提供重要数据，从而达到优生优育的目的;结合临床数据深入认识患者的临床表型，探讨SSADH缺陷病基因型与临床表型之间相关性，以利于SSADH缺陷病发病机制研究。
　　方法:
　　1.收集整理分析SSADH缺陷病患儿临床病史资料和主要检查结果。
　　2.应用聚合酶链式反应(PCR)和直接测序法对SSADH缺陷病患儿ALDH5A1基因各个外显子及其两侧部分内含子序列进行突变检测分析。
　　3.对检测到的突变用PCR-直接测序方法对患儿父母进行突变携带情况检测分析。
　　4.针对新突变采用特异性碱基错配引入限制性内切酶方法，自行设计错配引物介导PCR，再用相应的限制性内切酶进行酶切反应，分析新突变在正常人群中的发生频率，以判断新突变的性质。
　　5.使用DNA MAN软件对人类和其它种属SSADH突变氨基酸序列进行同源性比较;模拟人类SSADH空间结构分析突变对蛋白质结构的影响。
　　结果:
　　1.在本研究的7例患儿中临床资料相对完整，发病年龄为12天～2岁，诊断年龄为86天～5岁，临床表现有抽搐、语言和运动发育落后、肌张力低下、反射减弱、智力低下等，一般生化检查均无异常（除一例因频繁抽搐出现代谢性酸中毒外），脑电图(EEG)和头颅核磁共振（MRI）异常，气相色谱-质谱(GC-MS)检测尿中γ-羟基丁酸、2，4二羟基丁酸、3，4二羟基丁酸和4，5-二羟基己酸异常成分水平增高。
　　2.7例患儿均检测出突变位点，共检测到9种突变，其中c.527G＞A、c.691G＞A、c.1568C＞T、“c.839T＞G、c.904G＞A、c.1022C＞A、c.1383-2delA为尚未报道突变，突变c.538C＞T和c.545C＞T为已报道的多态性改变。突变类型以错义突变为主。7例患儿中4例存在c.1568C＞T突变，占突变等位基因的42.9％(6/14等位基因)。患儿基因突变均来自父母（除1例试管婴儿之父外），为非新生突变。
　　3.新突变位点c.527G＞A、c.691G＞A、c.1568C＞T、c.1022C＞A在100例健康人中均未检测到。
　　4.同源序列分析中p.Gly176Glu、p.Glu231Lys、p.Ser523Phe、p.Gly302Arg、p.Ala341Asp突变位点序列处于高度保守氨基酸区域，p.Va1280Gly突变位点处于保守氨基酸区域。
　　结论:
　　1.在7个琥珀酸半醛脱氢酶缺陷病家系中共检测出9种突变类型(c.527G＞A、c.691G＞A、c.1568C＞T、c.839T＞G、c.904G＞A、c.1022C＞A、c.1383-2delA、c.538C＞T和c.545C＞T)，其中错义突变6种，剪接缺失1种，多态性改变2个。其中7种新突变丰富了SSADH基因突变谱。
　　2.SSADH基因突变检测发现中国人群突变类型以错义突变为主，其中c.1568C＞T突变为热点突变，占分析的42.9％。
　　3.本研究中患儿存在的突变等位基因位点，经验证均分别源于父母（除1例试管婴儿之父外），为非新生突变，并符合常染色体隐性遗传规律。
　　4.本研究群体SSADH基因突变存在较高的遗传异质性，基因型与临床表型关系较难确定。
　　5.限制性内切酶酶切分析100名正常对照者均未显示有突变位点的存在，故推测这些突变为致病性突变。
　　6.新发现的6种错义突变位点对应的蛋白序列在7种种属中进行同源序列分析，结果发现p.Gly176Glu、p.Glu231Lys、p.Ser523Phe、p.Gly302Arg、p.Ala341Asp突变位点序列处于高度保守氨基酸区域，p.Va1280Gly突变位点序列处于保守氨基酸区域。
　　7.本研究的基因突变分析为临床研究SSADH缺陷病的家系分析和产前诊断提供了实验方法和新的诊断依据。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、琥珀酸半醛脱氢酶缺陷病临床及基因突变分析

1．1 对象和方法

1．1．1 研究对象

1．1．2 主要仪器

1．1．3 主要试剂

1．1．4 主要计算机分析软件

1．1．5 临床资料

1．1．6 分子生物学实验方法

1．2．结果

1．2．1 临床资料分析

1．2．2 DNA质量测定

1．2．3 PCR扩增产物电泳结果

1．2．4 ALDH5A1基因测序结果

1．3 讨论

1．3．1 琥珀酸半醛脱氢酶缺陷病的临床特点

1．3．2 ALDH5A1基因突变

1．3．3 基因型与临床表型分析

二、新突变性质及突变蛋白结构分析

2．1 材料与方法

2．1．1 对象

2．1．2 仪器和试剂

2．1．3 主要计算机分析软件

2．1．4 实验方法

2．2 结果

2．2．1 限制性内切酶酶切产物结果分析

2．2．2 突变蛋白同源序列比较和突变对蛋白空间结构影响分析

2．3 讨论

结论

不足与展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 琥珀酸半醛脱氢酶缺陷病研究进展

致谢