吸烟诱导水解酶活性微囊泡在粥样斑块薄壁纤维帽进展中的研究

摘要

目的:
　　 吸烟明显增加动脉粥样硬化（Atherosclerosis， AS）斑块的破裂和破裂后血管内血栓形成的危险性，然而相关分子机制尚不明确。微囊泡(Microvesciles，MVs)是细胞凋亡过程中产生的膜性囊状结构，近年研究证实动脉粥样斑块中存在大量单核巨噬细胞源性MVs，其致病力较母细胞更强、更持久，与AS斑块的进展密切相关。我们前期研究发现，TSE（Tobacco smoke extract，TSE）可增加单核细胞源性MVs的产生，该MVs携带组织因子，体外具有强大的促凝活性，解释了吸烟患者血液的高凝状态和斑块破裂后血栓形成的机制，但尚不能够解释吸烟患者AS斑块破裂的机制。因此，本研究旨在探讨TSE诱导巨噬细胞源性MVs是否具有蛋白水解酶活性，并探讨TSE诱导的蛋白水解酶活性MVs的分子性质和产生的分子信号通路机制。
　　 方法:
　　 1.PMA诱导人THP-1单核细胞建立巨噬细胞模型和贴壁筛选法分离诱导外周血单核巨噬细胞;
　　 2.酶谱法和荧光底物分解法测量TSE诱导MVs水解酶活性;
　　 3.在37℃应用Pro-MMP2与分离MVs体外共孵育1h，然后用酶谱法检测TSE诱导MVs激活Pro-MMP2的活性;
　　 4.免疫荧双染色共聚焦显微镜观察TSE诱导巨噬细胞膜性基质金属蛋白酶1(membrane type1 metalloproteinase，MT1-MMP)又称MMP14和细胞凋亡早期标志物磷脂酰丝氨酸(PS)表达及分布;
　　 5.Western Blot检测TSE诱导巨噬细胞MMP14蛋白表达变化、MAPKs信号通路的激活和MVs携带MMP14情况;
　　 6.应用流式细胞技术测量TSE诱导总MVs和MMP14+MVs数量;
　　 7.应用凋亡抑制剂(caspase inhibitor，CASPi)，观察TSE诱导MMP14+MVs的产生和活性;
　　 8.应用MAPKs信号通路p38/ERK/JNK特异性抑制剂干预细胞后，观察TSE诱导MVs产生和活性。
　　 结果:
　　 1.成功应用PMA建立THP-1巨噬细胞和贴壁筛选法分离诱导人外周血原代单核巨噬细胞;
　　 2.TSE诱导MVs可动态水解人工合成荧光底物肽段1和降解凝胶中天然底物明胶蛋白和胶原蛋白;
　　 3.TSE诱导MVs可激活人工重组Pro-MMP2的活性，级联放大效应发挥水解胶原蛋白的活性;
　　 4.TSE诱导巨噬细胞呈浓度和时间依赖性增加MMP14的表达，共聚焦显微镜显示MMP14在巨噬细胞膜上呈结节性表达增加且与细胞膜的早期凋亡标志分子PS共定位，提示TSE诱导MVs携带MMP14;
　　 5.流式分析显示TSE可诱导巨噬细胞源性总MVs和MMP14+MVs的产生;
　　 6.CASPi可明显抑制TSE诱导巨噬细胞源性总MVs和MMP14+MVs的产生，并抑制MVs水解酶活性，不影响巨噬细胞表达MMP14;
　　 7.TSE可激活MAPKs信号通路，使通路重要蛋白p38、ERK和JNK磷酸化，其中p38和JNK磷酸化与TSE诱导的巨噬细胞表达MMP14有关，与ERK的磷酸化无关;
　　 8.应用p38和JNK特异性抑制剂可明显减少TSE诱导的MMP14+MVs的数量和活性。
　　 结论:
　　 TSE干预巨噬细胞可明显增加蛋白水解酶活性MVs产生，与其携带的跨膜蛋白酶基质金属蛋白酶家族的MMP14有关，具有强大胶原和明胶蛋白酶的活性;TSE诱导的水解酶活性MVs产生与MAPKs信号通路中JNK和p38的磷酸化有关，与ERK磷酸化无关。我们的研究提示TSE诱导的蛋白水解酶活性MVs可能在AS斑块薄壁纤维帽形成中起着重要作用，是斑块破裂新的致病因子。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、巨噬细胞模型的建立和鉴定

1．1 对象和方法

1．1．1 实验对象

1．1．2 主要仪器和耗材

1．1．3 主要试剂

1．1．4 主要试剂配置

1．1．5 实验方法

1．2 结果

1．2．1 倒置相差显微镜观察THP-1巨噬细胞形态学变化

1．2．2 优化PMA用量

1．2．3 倒置相差显微镜观察人原代巨噬细胞形态学变化

1．2．4 免疫荧光染色和流式细胞仪鉴定巨噬细胞

1．3 讨论

1．3．1 巨噬细胞在动脉粥样斑块的破裂中起着关键核心作用

1．3．2 巨噬细胞模型的选择

1．3．3 THP-1巨噬细胞模型的建立和鉴定

1．4 小结

二、吸烟对巨噬细胞源性微囊泡蛋白水解酶活性的影响

2．1 对象和方法

2．1．1 实验对象

2．1．2 主要仪器和耗材

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要试剂的配置

2．1．5 实验方法

2．2 结果

2．2．1 TSE干预THP-1巨噬细胞和原代hMDMs释放水解酶活性的MVs

2．2．2 TSE诱导巨噬细胞源性的MVs携带MMP14

2．2．3 TSE诱导巨噬细胞增加MMP14的表达

2．2．4 PS转位与MMP14蛋白表达增加在巨噬细胞膜上共定位

2．2．5 TSE浓度依赖性增加巨噬细胞凋亡

2．2．6 TSE诱导巨噬细胞释放MVs和携带MMP14的MVs(MMP14+MVs)

2．2．7 TSE诱导巨噬细胞释放MVs可激活pro-MMP2

2．3 讨论

2．3．1 易损斑块是急性心血管疾病的罪行病变

2．3．2 巨噬细胞凋亡是AS易损斑块发展的主要病变细胞

2．3．3 MMP14+MVs与动脉粥样易损斑块薄壁纤维帽形成的关系

2．3．4 MVs携带的MMP14激活Pro-MMP2放大降解细胞外基质的作用

2．3．5 创新点与限制性

2．4 小结

三、巨噬细胞源性水解酶活性微囊泡产生的机制研究

3．1 对象和方法

3．1．1 实验对象

3．1．2 主要仪器和耗材

3．1．3 主要试剂和配置

3．1．4 实验方法

3．2 结果

3．2．1 凋亡是TSE诱导巨噬细胞释放水解酶活性MMP14+MVs的主要机制

3．2．2 TSE对巨噬细胞MAPKs激酶信号通路的影响

3．2．3 MAPKs激酶信号通路对TSE诱导巨噬细胞MMP14表达的影响

3．2．4 MAPKs激酶信号通路对TSE诱导巨噬细胞凋亡的影响

3．2．5 MAPKs激酶信号通路对TSE诱导MMP14+MVs产生的影响

3．2．6 MAPKs激酶信号通路对TSE诱导MVs水解酶活性的影响

3．3 讨论

3．3．1 细胞凋亡是TSE诱导巨噬细胞源性MMP14+MVs产生的主要机制

3．3．2 TSE诱导巨噬细胞MAPKs信号通路激活

3．3．3 TSE通过激活MAPKs信号通路JNK和p38介导了上调MMP14的表达

3．3．4 MAPKs信号通路激活与TSE诱导巨噬细胞源性MMP14+MVs释放的关系

3．3．5 创新点与限制性

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 微囊泡在动脉粥样硬化发生发展中的作用

致谢