前列腺癌异常表达microRNAs的筛选及miRNA-182作用机制的初步研究

摘要

前列腺癌是老年男性常见的恶性肿瘤，前列腺癌的预后与前列腺癌的治疗方式有很大关系。虽然包括手术、内分泌治疗、放化疗和生物治疗等传统的治疗手段，对于局限性前列腺癌有很好的疗效。但是对于转移性前列腺癌的治疗仍然是一个世界难题。因此，探索前列腺癌浸润及转移的分子机制，寻找新的前列腺癌的治疗靶点是目前前列腺癌治疗研究的重点。miRNAs是一类内生的、长度约19-25个核苷酸的ncRNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。成熟的microRNA通过与mRNA的3’端UTR部分互补识别引起特定的靶mRNA沉默。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，越来越多的证据表明，miRNA可以调控那些与发育、增殖、凋亡及应激反应相关的基因，对细胞自身稳定和发育起着重要作用，而且它们的表达异常是人类恶性肿瘤的一个共同特征。miRNA在包括前列腺癌在内的多种恶性肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用。但是miRNAs在前列腺癌发生、发展中的作用的研究近几年才刚刚起步。并且，随着大量新的miRNAs被发现，这些新miRNAs在前列腺癌中的表达也需要被及时检测与分析。
　　第一部分前列腺癌差异表达miRNAs的筛选
　　目的筛选前列腺癌差异表达miRNAs。
　　方法收集了2010年1月至2012年12月期间手术切除的前列腺癌标本5例、良性前列腺增生标本3例。首先运用目前最新版的miRNAs生物芯片技术筛选出前列腺癌的差异表达miRNAs，然后运用RT-PCR方法验证了芯片结果。最终选出最有可能与前列腺癌增殖、转移相关的miRNA，作为进一步研究的对象。
　　结果通过miRNAs芯片分析和RT-PCR验证，我们共发现前列腺癌中差异表达miRNA27个，其中表达下调的miRNA5个(miR-345，miR-145，miR-221，miR-27b和miR-378)，表达上调的miRNA22个，其中miR-182的表达相比良性前列腺增生组织明显升高。
　　结论前列腺癌组织中存在着差异表达miRNAs，其中miR-182在前列腺癌组织中的表达明显升高。因此，下一步将进一步研究miR-182在前列腺癌中的作用。
　　第二部分前列腺癌异常表达miRNAs功能研究
　　目的探讨miRNA-182在前列腺癌增殖、凋亡、细胞侵袭方面的作用。
　　方法用RT-PCR方法检测人正常前列腺上皮细胞系RWPE-1和四种前列腺癌细胞系（PC-3，DU145，22Rv1和LNCaP）中miRNA-182的表达，为了研究此miRNA在前列腺癌中的作用，我们合成了miRNA mimics和miRNAinhibitros，并通过Lipofectamine2000转染前列腺癌PC-3细胞系，RT-PCR检测转染后miRNA-182表达的变化，MTT检测细胞转染前后PC-3细胞增殖能力变化;流式细胞术检测PC-3细胞周期及凋亡的变化;Transwell检测PC-3细胞侵袭能力的变化。从而探讨异常表达的miRNA-182在前列腺癌发生、发展中的作用。
　　结果我们发现miRNA-182在这四种前列腺癌细胞系中的表达均高于正常前列腺上皮细胞系RWPE-1，并且PC-3细胞系中miRNA-182表达上调最明显，因此我们选择PC-3细胞系用于进一步研究。利用Lipofectamin2000转染miRNA-182 mimics和miRNA-182 inhibitor及其阴性对照至PC-3细胞系后，RT-PCR检测结果显示miRNA-182 mimics和miRNA-182 inhibitor能明显上调及下调miRNA-182的表达水平，达到进一步研究的要求。MTT实验检测PC-3细胞的增殖能力发现，上调PC-3细胞中的miRNA-182表达，能明显提高细胞的增殖能力(P＜0.05），相反下调PC-3细胞中miRNA-182表达水平，细胞的增殖能力受到抑制(P＜0.05）;上调PC-3细胞中miRNA-182的表达能够促进细胞从G0-G1期进入S期，相反下调PC-3细胞中miRNA-182表达，细胞在G0-G1明显阻滞，并伴随S期细胞的显著减少;转染miRNA-182 mimics后PC-3细胞的凋亡率明显低于miRNA-182 mimics对照组，相反，转染miRNA-182 inhibitor后PC-3细胞的凋亡率要显著高于miRNA-182 inhibitor对照组;将miRNA-182mimics和miRNA-182 inhibitor及其对照转染入PC-3细胞后，利用Transwell实验检测其侵袭能力的变化，结果显示，转染miRNA-182 mimics后细胞的侵袭能力明显高于对照组，而转染miRNA-182 inhibitor细胞的侵袭能力明显下降。
　　结论 miR-182在前列腺癌细胞中表达明显高于正常前列腺上皮细胞，并且前列腺癌PC-3细胞中miR-182表达差异最明显。miR-182能促使PC-3细胞由G0-G1期进入S期，并通过抑制PC-3细胞的早期凋亡促进细胞的增殖。上调PC-3细胞中miR-182的表达能促进细胞的侵袭。
　　第三部分前列腺癌差异表达miRNAs靶基因研究
　　目的预测miR-182的可能靶基因，并验证其作用靶点，阐明miR-182的分子作用机制。
　　方法利用生物信息学技术如TargetScan，miRBase和PicTar等优秀数据库，预测miRNA可能的靶基因，然后利用Westem blot和荧光素酶双报告基因检测验证预测靶基因的准确性。从而探明miRNA-182在前列腺癌中可能的分子作用机制。
　　结果利用生物信息学技术预测miR-182的可能靶基因为NDRG1。WesternBlot实验结果显示转染miRNA-182 mimics组细胞的NDRG1蛋白含量明显低于miRNA-182 mimics-NC组，转染miRNA-182 inhibitor组细胞中NDRG1蛋白含量显著高于miRNA-182 inhibitor-NC组;我们成功合成了pmirGLO/NDRG2-UTR载体系统，并将pmirGLO/NDRG1-UTR载体与miRNA-182 mimics、miRNA-182 inhibitor共转染PC-3细胞，结果显示转染miRNA-182 mimics上调miRNA-182的表达能明显抑制pmirGLO/NDRG1-UTR的荧光素酶活性，相反，转染miRNA-182 inhibitor下调miRNA-182的表达，pmirGLO/NDRG1-UTR的荧光素酶活性增强。
　　结论 miR-182是通过直接与NDRG13'UTR区结合后下调NDRG1的表达，从而促进前列腺癌PC-3细胞的增殖及侵袭的。miR-182可以作为一种新的前列腺癌基因治疗的靶基因。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分：前列腺癌差异表达microRNAs的筛选

1．1 材料和方法

1．1．1 实验材料

1．1．2 实验方法

1．1．3 统计学分析

1．2 实验结果

1．3 讨论

1．4 小结

第二部分 前列腺癌异常表达miRNAs功能研究

2．1、材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 统计学分析

2．2 实验结果

2．3．讨论

2．4．小结

第三部分 前列腺癌差异表达miRNAs靶基因研究

3．1、材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．1．3 统计学方法

3．2、实验结果

3．3．讨论

3．4．小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述一 MicroRNAs与前列腺癌

综述二 N-myc下游调节基因1与前列腺癌

致谢