基于光学比浊法和VASP磷酸化法评价STEMI患者血小板反应性的差异性分析

摘要

研究目的:冠状动脉内血栓形成引起的急性心肌梗死(myocardial infarction，MI)是影响全球人口健康水平的重要原因之一。血小板在血栓形成过程中扮演着重要角色。动脉粥样硬化斑块破裂引起血管内皮受损后，血小板黏附于受损的血管内皮下基质，相互聚集并促进血凝块的形成，进而引起血管的阻塞。因此，以血小板激活通路为靶点的治疗—包括血栓素A2合成、二磷酸腺苷(Adenosine Diphosphate，ADP)介导的信号通路及GPⅡb/Ⅲa信号通路在心血管疾病的治疗中起着重要作用。当前，最常用的抗血小板药物包括阿司匹林、氯吡格雷和替罗非班等。已有明确的证据证实MI患者抗血小板治疗能够显著降低病死率和心血管事件的发生率。但是，在临床上有一部分患者，尽管应用了标准的联合抗血小板治疗，仍无法有效降低心血管事件的发生，这一现象被称为血小板反应多样性(variability of response，VPR)。影响血小板反应多样性的因素很多，包括患者基线存在的危险因素，药物与药物之间相互作用，如应用质子泵抑制剂(proton pump inhibitors，PPI)，细胞色素P450系统的基因多态性等。目前常用于检测血小板功能的方法很多，包括光学比浊法(light transmissionaggregometry，LTA)测量ADP诱导的血小板聚集率(platelet aggregation，PAG)和通过流式细胞术测定的血小板血管舒张剂刺激磷蛋白(vasodilator stimulatedphosphoprotein，VASP)磷酸化水平[评价指标为血小板反应指数(plateletreactivity index，PRI)]以及血栓弹力图等，在这些方法中，LTA法和VASP磷酸化法是广泛应用的经典方法。已有研究显示，应用不同的检测方法对血小板功能的检测也存在差异性，直接导致了评价结果的差异，但其影响因素尚不明确。鉴于此，本研究以急性心肌梗死患者为研究对象，应用LTA法和VASP磷酸化法两种方法评估血小板对氯吡格雷的反应性，并分析两种方法检测的一致性及差异性，探讨影响评价结果差异的因素，为临床实践中合理判断血小板反应性提供参考。
　　研究内容与方法:以连续入选的在中国人民武装警察部队后勤学院附属医院心脏中心接受急诊经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）的ST段抬高型心肌梗死(ST segment elevated myocardial infarction，STEMI)患者90例为研究对象，所有入选患者STEMI的诊断符合2013《ACC/AHA急性 ST段抬高型心肌梗死管理指南》的诊断标准。记录入选患者的一般临床资料、病史及用药情况;进行各项血细胞参数、生化参数的检验。所有入选患者于入院后即刻口服阿司匹林300mg和氯吡格雷300mg，PCI术后继续接受氯吡格雷（75 mg，1/日）和阿司匹林（100 mg，1/日）双联抗血小板治疗。在PCI术后第6天取肘正中静脉血进行CYP2C19*2/*3基因多态性、PAG及PRI的检测。分别以LTA法和VASP磷酸化法探讨入选患者血小板对氯吡格雷的反应性，并评价两种方法检测血小板功能的一致性及评估结果出现差异的影响因素。
　　结果:本研究共纳入符合标准的STEMI患者90例，其中男性70人，平均年龄（58.83±10.47）岁，女性20人，平均年龄（64.80±9.39）岁。
　　1)依据LTA法测定的血小板聚集率(PAG)的中位数水平(65.5％)将入选患者分为两组:PAG-正常反应(PAG-normal responders，PAG-NR)组，PAG＜65.5％，男性39例，女性10例;PAG-低反应(PAG-low responders，PAG-LR)组，PAG＞65.5％，男性30例，女性11例。两组患者年龄、性别、吸烟史、BMI、临床用药、病史资料、CYP2C19*2/*3基因多态性、各项血细胞参数及生化参数的检验结果比较差异无统计学意义(P＞0.05);相关性分析结果示，PAG与年龄、BMI、各项血细胞参数及生化参数的检验结果均无相关性(P＞0.05)。
　　2)依据流式细胞术测定的VASP磷酸化水平即血小板反应指数PRI的中位数水平(41.85％)分成2组:PRI-正常反应（PRI-normal responders，PRI-NR）组，PRI＜41.85％，男性34例，女性11例;PRI-低反应(PRI-low responders，PRI-LR)组，PRI＞41.85％，男性36例，女性9例。两组患者年龄、性别、吸烟史、BMI、临床用药、病史资料、CYP2C19*2/*3基因多态性、各项血细胞参数及生化参数的检验结果比较差异无统计学意义(P＞0.05);相关性分析结果示，PRI与年龄、BMI、各项血细胞参数及生化参数的检验结果均无相关性(P＞0.05)。
　　3) PAG与PRI的相关性分析结果显示，二者呈正相关(r=0.4278，P＜0.0001);PAG与PRI的Bland-Altman一致性分析结果显示，偏倚=-19.07，标准差=21.64。
　　4)把PAG与PRI均判断为低反应组或正常反应组者定义为结果一致组，反之，PAG判断为低反应组而PRI判断为正常反应组者或PAG判断为正常反应组而PRI判断为低反应组者定义为结果不一致组，建立新的变量，探讨影响两种检测方法结果差异的因素;经单因素分析显示，BMI、白细胞计数、单核细胞计数、吸烟、高血压、脑卒中及应用ARB类药物可能影响两种检测方法结果的一致性;经Logistic多元回归分析显示，吸烟是PAG与PRI对血小板反应性结果判读不一致的独立相关因素(OR:3.333，95％CI:1.120-9.917，P=0.030)，而且在经年龄、性别、高血压、糖尿病等传统心血管疾病危险因素校正后，结果仍有统计学意义(OR:4.399，95％CI:1.105-17.522，P=0.036)。
　　结论:本研究首次探讨了STEMI患者在双联抗血小板治疗后采用LTA法和VASP磷酸化法评价患者血小板反应性不一致的潜在原因。我们的结果显示吸烟是独立的与两种方法检测结果差异相关的因素，为临床实践中合理判断血小板反应性提供了参考依据，但本研究的结果尚需在更大样本中进一步证实。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1．1 研究对象

1．2 一般情况调查

1．3 生化指标检测方法

1．3．1 血常规的检测

1．3．2 肾功能的检测

1．3．3 肝功能、血脂、血糖的检测

1．4 光学比浊法血小板聚集率的测定

1．4．1 检测原理

1．4．2 主要仪器及耗材

1．4．3 血样采集

1．4．4 检测步骤

1．5 血小板VASP磷酸化水平的测定

1．5．1 检测原理

1．5．2 主要仪器及耗材

1．5．3 血样采集

1．5．4 检测步骤

1．6 CYP2C19*2／*3基因多态性的鉴定

1．6．1 主要仪器及耗材

1．6．2 全血基因组DNA提取

1．6．3 全血基因组DNA的定量

1．6．4 CYP2C19*2／*3的PCR基因扩增

1．6．5 PCR产物的纯化

1．6．6 限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳

1．7 统计学分析

结果

2．1 一般资料

2．2 PAG-NR组与PAG-LR组临床资料的比较结果

2．3 PAG与临床资料中定量资料的相关性分析结果

2．4 PRI-NR组与PRI-LR组临床资料的比较结果

2．5 PRI与临床资料中定量资料的相关性分析结果

2．6 PAG与PRI的相关性分析结果

2．7 PAG与PRI的一致性分析结果

2．8 以PAG与PRI结果的差异性的分组

2．9 结果一致组与结果不一致组临床资料的比较结果

2．10 PAG与PRI结果一致性影响因素的Logistic回归分析结果

讨论

3．1 血小板氯吡格雷低反应性的定义

3．2 血小板反应性的检测方法

3．3 血小板氯吡格雷低反应性的影响因素

研究局限性

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 血小板氯吡格雷低反应性的研究进展

致谢