适配蛋白LAT在重型再生障碍性贫血T细胞活化过程中的作用机制的研究

摘要

目的：
　　通过研究重型再生障碍性贫血(Severe Aplastic Anemia，SAA)患者外周血CD3+T淋巴细胞中T细胞活化衔接因子(Linker for activation of T cells，LAT)表达水平、LAT的表达与SAA患者CD8+T细胞功能的关系以及LAT在T细胞中的作用机制，证实LAT与SAA患者T细胞过度增殖及功能亢进之间的因果效应，进一步阐明SAA免疫损伤骨髓造血的机制，为开发SAA靶向治疗提供理论依据。
　　方法：
　　研究对象为天津医科大学总医院2012年9月至2013年9月初治SAA患者14例、治疗后缓解的SAA患者12例及正常对照者12例。
　　第一部分研究SAA患者外周血T细胞中LAT的表达水平及其与CD8+T细胞功能的关系，采用流式细胞术检测14例初治SAA患者、12例治疗后缓解的患者及12例正常对照者外周血T细胞LAT及其相关信号分子ZAP-70及pLAT的表达，以及外周血CD8+T细胞中LAT的表达水平及穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)的表达。采用免疫磁珠分选以上病例外周血CD3+T细胞，实时定量PCR检测分选细胞LAT mRNA的表达水平。将以上病例外周血T细胞中LAT的表达水平和T细胞比例做了相关分析，以及将外周血CD8+T细胞中LAT的表达分别和CD8+T细胞上穿孔素和颗粒酶B的表达做相关性分析。
　　第二部分研究LAT在T细胞中的作用机制。以免疫磁珠分选10例初治SAA患者外周血CD3+T细胞，分为两组，分别转染LAT-siRNA和阴性对照，孵育48h后流式细胞术检测CD8+T细胞穿孔素和颗粒酶B的表达水平，用ELISA法检测培养液IL-4和IFN-γ的浓度水平。免疫磁珠分选7例健康人外周血CD3+T细胞，分为两组，分别转染pCMV-myc-LAT和pCMV-myc质粒，孵育48h后，再分别加入K562细胞共培养48h，流式细胞术检测CD8+T细胞穿孔素和颗粒酶B的表达水平以及K562细胞的凋亡状况，并用ELISA检测培养液中IL-4和IFN-γ的浓度水平。
　　结果：
　　第一部分 SAA初治组CD3+T细胞中LAT、ZAP-70和pLAT的中位表达量分别为49.55(26.97-91.34)％，33(17.31-85.41)％和8.31(3.3-13.39)％，正常对照组CD3+T细胞中LAT、ZAP-70和pLAT的表达量分别为14.81(1.76-29.64)％，4.06(1.16-9.93)％和0.27(0-0.82)％，前者明显高于后者(P＜0.01)。SAA初治组CD3+T细胞中LAT mRNA的相对表达量为5.484(3.418-7.905)，正常对照组CD3+T细胞中LAT mRNA的表达量为1.305(0.462-2.545)，前者明显高于后者(P＜0.01)。经过免疫抑制治疗后，SAA缓解组CD3+T细胞中LAT、ZAP-70、pLAT及LAT mRNA的表达量分别为30.25(24.25-58.24)％，19.23(6.33-54.45)％，2.29(0.46-7.99)％和3.897(0.538.7.934)，明显低于SAA初治组(P＜0.01)。T细胞中LAT的表达量和T细胞比例呈正相关(r=0.1831，P＜0.05)。外周血CD8+T细胞中穿孔素的表达量和CD8+T细胞中LAT的表达量呈正相关(r=0.6503，P＜0.05)，外周血CD8+T细胞中颗粒酶B的表达量和CD8+T细胞中LAT的表达量也呈正相关(r=0.1936，P＜0.05)。
　　第二部分1.LAT敲低组中CD3+T细胞中LAT、CD8+T细胞中穿孔素和颗粒酶B的中位表达量分别为32.52(19.63-45.55)％，2.015(0.39-13.02)％和18.99(1.27-42.78)％，阴性对照组中CD3+T细胞中LAT、CD8+T细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达量分别为59.14(38.15-82.08)％，6.73(1.82-25.09)％和40.215(6.36-66.25)％，前者明显低于后者(P＜0.05)。ELISA测LAT敲低组上清中IFN-γ的中位浓度为15.633(11.394-18.975)pg/ml，明显低于阴性对照组，IL-4的中位浓度为12.196(8.336-14.966)pg/ml，和阴性对照组相比没有统计学意义(P＞0.05)。2.LAT过表达组中CD3+T细胞中LAT，CD8+T细胞中穿孔素和颗粒酶B的中位表达量以及K562细胞的中位凋亡率分别为35.79(24.1-39.34)％、7.89(4.85-15.08)％、18.3(16.94-23.36)％和25(9.6-38.46)％，阴性对照组中CD3+T细胞中LAT，CD8+T细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达量以及K562细胞的凋亡率分别为15.39(7.35-18.7)％、3.3(1.96-6.91)％、11.41(8.25-14.66)％和12.33(2.5-14.84)％，前者明显高于后者(P＜0.05)。ELISA测LAT过表达组上清中IFN-γ的浓度为22.374(19.355-24.814)pg/ml，明显高于阴性对照组，IL-4的浓度为18.834(12.187-18.942)pg/ml，和阴性对照组相比没有统计学意义(P＞0.05)。
　　结论：
　　1、 SAA患者外周血T细胞中适配蛋白LAT的表达明显高于正常人，并且免疫抑制治疗可以显著降低LAT的表达。
　　2、 SAA患者外周血CD8+T细胞功能和LAT的表达呈正相关，LAT的低表达可降低CTL细胞的功能，LAT过表达则可造成CTL细胞的功能亢进，并增强其破坏造血干细胞的作用。
　　3、 LAT过表达可促进IFN-γ的分泌并抑制IL-4的分泌。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、重型再生障碍性贫血患者外周血CD3+T细胞中LAT表达水平的变化

1．1 对象和方法

1．1．1 研究对象

1．1．2 主要试剂与仪器

1．1．3 研究方法

1．2 结果

1．2．1 流式细胞仪检测分选细胞

1．2．2 实时定量PCR技术检测SAA患者外周血CD3+T细胞内LAT mRNA的表达

1．2．3 流式细胞术检测SAA患者外周血CD3+T细胞内LAT及其相关信号分子ZAP-70和pLAT的表达

1．2．3 所有病例外周血CD3+T细胞比例与CD3+T细胞内LAT的表达的相关性

1．2．4 所有病例外周血CD8+T细胞功能与CD8+T细胞内LAT的表达的相关性

1．3 讨论

1．4 小结

二、LAT在重型再生障碍性贫血T细胞中的作用机制

2．1 对象和方法

2．1．1 研究对象

2．1．2 主要试剂与仪器

2．1．3 研究方法

2．2 结果

2．2．1 流式细胞仪检测分选细胞

2．2．2 LAT敲低组中CD4+T细胞及CD8+T细胞功能的测定

2．2．3 LAT过表达组中CD4+T细胞及CD8+T细胞功能的测定及K562细胞凋亡的测定

2．2 讨论

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 LAT在T淋巴细胞活化过程中作用研究进展

致谢