姜黄素提高hESCs向RPE定向诱导效率的相关研究

摘要

目的:
　　本实验主要研究姜黄素(Curcumin)对人胚胎干细胞(Human embryonic stemcells，hESCs)向视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）定向分化的影响。并初步探姜黄素在体外诱导人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化过程中对Wnt/β-catenin信号通路的影响，为进一步提高hESC向RPE定向诱导效率和推动视网膜变性疾病细胞治疗的临床转化提供理论依据。
　　方法:
　　(1) hESCs购于美国Stemcell公司。体外培养hESCs，在hESCs自主分化14天的基础上以Curcumin处理细胞，具体分组如下:
　　①Curcumin剂量梯度实验:实验设置6个Curcumin作用剂量，终浓度分别为:0μmol/L（对照）、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L。Curcumin处理24h后更换为正常诱导分化培养基。观察各组细胞色素化情况。收集分化第22天和第36天细胞，采取荧光定量RT-PCR检测各组细胞干细胞标志基因及RPE标志基因的表达水平。选取RPE标志基因表达水平最高的Curcumin浓度进行后续试验。
　　②Curcumin时间梯度实验:根据上述实验结果选取1μmol/L的Curcumin作用浓度，实验设置5个作用时间，分别为:0h组（对照）、24h组、3天组、1W组和2W组。Curcumin处理时间到后更换为正常诱导分化培养基。观察各组细胞色素化情况。收集分化第22天和第36天细胞，采用荧光定量RT-PCR检测各组细胞干细胞标志基因及RPE标志基因的表达水平。
　　(2)人RPE（hRPE）分离培养与鉴定:因眼外伤而摘除的健康青年人眼球，于手术后立即分离出视网膜，经胰酶消化后轻轻刮取RPE细胞层，收集细胞悬液离心沉淀后以1×108个/L的密度接种于25cm2培养瓶，在37℃，饱和湿度及5％ CO2条件下培养。每2d用含10％胎牛血清的DMEM培养液半量换液1次，当细胞生长至90％融合状态时传代。采用Western-blot检测hRPE中CRALBP、RPE65和MITF蛋白的表达;采用与聚苯乙烯荧光微球共孵育12h检测hRPE细胞的吞噬功能。
　　(3)诱导来源的RPE(iRPE)的纯化与鉴定:利用RPE细胞的色素化外观，机械分离明显色素化的细胞，进行传代培养并反复提纯，得到较纯的iRPE。采用Western blot法检测iRPE细胞RPE65、MITF及CRALBP蛋白的表达;采用免疫荧光检测iRPE细胞Zo-1、MITF和PAX6蛋白的表达;采用与聚苯乙烯荧光微球与iRPE共培养检测iRPE细胞吞噬功能。
　　(4) Curcumin处理hESCs向RPE定向分化过程中对Wnt/β-catenin信号通路的影响:采用荧光定量RT-PCR技术检测对照组与实验组Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因Lef1、TCF7、MYC mRNA的表达水平。
　　结果:
　　(1) Curcumin剂量梯度实验:经Curcumin处理能明显促进hESCs向RPE定向分化。其中，Curcumin1μM和2μM组细胞色素化程度最高。5μM组产生的色素化细胞次之，10μM和20μM组产生色素化改变的细胞少于5μM组，且细胞生长受到抑制，逐渐凋亡。RT-PCR结果显示，经Curcumin处理后各组细胞RPE标志基因PAX6、CRALBP及RPE65表达水平明显增高，与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。其中Curcumin终浓度1μM组和2μM组RPE标志基因表达水平最高。当Curcumin作用浓度逐渐增高时，PAX6、CRALBP和RPE65的表达水平逐渐降低。
　　(2) Curcumin时间梯度实验:经Curcumin处理实验组细胞色素化更明显。其中，24h组细胞色素化程度最高。3d组细胞次之。1W组与2W组细胞色素化较少，且长时间Curcumin处理至细胞数量减少，生长状态欠佳。RT-PCR结果显示，经Curcumin处理后各组细胞RPE标志基因PAX6、CRALBP及RPE65表达水平明显增高，其中24h组＞3d组＞1W组＞2W，与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。延长Cuecumin处理时间PAX6、CRALBP和RPE65的表达水平逐渐降低，甚至低于对照组。
　　(3)人RPE（hRPE）分离培养与鉴定:体外培养的hRPE呈贴壁生长，细胞呈不规则多角形、单层排列。胞浆内聚集大量色素颗粒。经Western-blot检测hRPE中CRALBP、RPE65和MITF蛋白阳性表达;经聚苯乙烯荧光微球共孵育12h后hRPE胞质内清晰可见大量聚苯乙烯荧光微球信号。
　　(4) iRPE的纯化与鉴定:经Western blot检测iRPE细胞RPE65、MITF及CRALBP蛋白阳性表达;经免疫荧光检测iRPE细胞Zo-1、MITF和PAX6蛋白阳性表达;经聚苯乙烯荧光微球与iRPE共孵育证实iRPE细胞具备吞噬功能。
　　(5) Curcumin处理hESCs向RPE定向分化过程中对Wnt/β-catenin信号通路的影响，经荧光定量RT-PCR技术检测实验组Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因LEF1、TCF7、MYC mRNA的表达水平显著高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　(1)较低剂量的Curcumin(终浓度＜10μmol/L)作用24h能够明显促进hESCs细胞色素化及RPE标志基因表达;高剂量的Curcumin（终浓度＞20μmol/L），促进hESCs细胞色素化及RPE标志基因表达效果不明显，且抑制细胞生长。
　　(2)终浓度1μmol/L的Curcumin处理细胞24h能够明显促进hESCs细胞色素化并促进细胞表达RPE标志基因;继续延长Curcumin处理时间对于促进hESCs细胞色素化及RPE标志基因表达效果不明显，且抑制细胞生长。
　　(3)通过Western blot检测分离培养的hRPE细胞RPE65、MITF及CRALBP蛋白的表达，证实所得细胞确实表达RPE细胞特异性蛋白;与聚苯乙烯荧光微球共孵育证实所得细胞具有RPE特异性的吞噬功能。证明我们所分离培养的确为人RPE细胞。
　　(4)通过Western blot检测证实iRPE细胞阳性表达RPE65、MITF及CRALBP蛋白;通过免疫荧光检测证实诱导所得细胞阳性表达Zo-1、MITF和PAX6蛋白;通过与聚苯乙烯荧光微球共孵育证实诱导所得细胞具备吞噬功能。证明诱导分化获得的细胞在体外生物学特性和功能类似于分离培养的人RPE细胞，说明本实验通过Curcumin处理hESCs，成功诱导其定向分化为RPE。
　　(5)在Curcumin定向诱导hESC向RPE分化过程中，Wnt信号通路下游靶基因表达水平显著增高，说明Wnt信号通路在Curcumin作用下被激活。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、姜黄素对hESCs向RPE定向诱导分化的影响

1．1 材料和方法

1．1．1 材料

1．1．2 方法

1．1．3 统计分析

1．2 结果

1．2．1 hESCs体外培养与传代

1．2．2人RPE(hRPE)的分离培养与鉴定

1．2．3 Curcumin处理对hESCs向RPE诱导分化的影响

1．2．4 iRPE的纯化培养与鉴定

1．3 讨论

1．3．1 RPE的发育过程

1．3．2 hRPE的获取和鉴定

1．3．3 体外诱导hESCs分化为RPE细胞

1．4 小结

二、姜黄素对hESCs向RPE诱导分化作用机制的研究

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．1．3 统计学分析

2．2 结果

2．3 讨论

2．3．1 Wnt／β-catenin信号通路在RPE发育中的作用

2．3．2 Curcumin通过Wnt／β-catenin信号通路促进hESCs向RPE诱导分化

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 Wnt信号通路在视网膜色素上皮发育中的作用

致谢