循环microRNAs208a,208b在急性ST段抬高心肌梗死诊断中的价值

摘要

急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）已经成为使全球范围内的致死和致残率上升的主要原因之一。急性心肌梗死(AMI)是指冠状动脉急性闭塞，出现持久而严重的心肌缺血所致的局部心肌急性坏死。最新研究表明，循环微小RNA(microRNA，miRNAs，miRs)可以辅助多种系统疾病的早期诊断。
　　目的:
　　本研究的主要目的在于探讨心肌特异性miR-208a、miR-208b作为急性心ST段抬高型肌梗死(acute STEMI)诊断指标的能力，并与cTnⅠ水平进行比较。分析miR-208a/b与心脏型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、脂质以及左心室射血分数之间的相关性。
　　因此将研究分成6个部分:
　　1.采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测急性ST段抬高心肌梗死后心肌血浆miRNAs(mir208a和mir208b)的水平。
　　2.评估循环miR-208a/b早期诊断AMI的可行性。
　　3.评估miR-208a和miR-208b的诊断价值，并与当前的金标准cTnⅠ和CK-MB进行比较。
　　4.采用ELISA法检测急性STEMI患者血浆h-FABP和hs-CRP水平，并探讨它们与心肌特异性miRNAs(mir208a和mir208b)的相关性。
　　5.评估miR-208a/b与血脂的相关性。
　　6.通过二维超声心动图检测左室射血分数，并评估其与心肌特异性miRNAs(mir208a和mir208b)的相关性。
　　方法:
　　分别对列入选自2012年12月至2013年10月，症状发作后12h内入住天津医科大学第二医院CCU病房的39例急性ST段抬高心肌梗死(STEMI)患者，25例不稳定心绞痛(UAP)患者，以及29例参加健康预防保健项目的心电图正常、临床确诊无心血管疾病的健康人。本研究经天津医科大学第二医院医学伦理委员会批准，取得了所有患者知情同意。
　　取血时间为AMI发病后12h内(3.5±2.93)。抽取2.5ml外周静脉血于ETDA管中，2h内在4℃条件下2000g离心15min，分离血浆转移至新的无RNA酶的试管中，并存储于-80℃直至RNA分离。第一份血液样本采集于患者刚入住冠心病监护病房(CCU)时，另一份则采集于次日早上6点(发病后16.46±4.98h)。另外，于招收时，抽取29例健康人的血浆样本一次作为健康对照组，且正常健康人静脉血均来自清晨空腹。对所有参与本研究项目的患者血标本的miR-208a、miR-208b表达水平进行测定，并与标准生物标志物cTnⅠ进行比较。从400μL血浆样本，提取miRNA，使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒（康为世纪，中国），将提取的miRNA反转录成单链cDNA。利用SYBR实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCRs)检测血浆中miR-208a和miR-208b的表达量。目前，还没有统一的使用于qRT-PCR的特定内参。所有qRT-PCR采用相对定量进行分析，以hsnRNA U6(HmiRQP9001，GeneCopoeia)作为内参进行校正和标准化。采用2-△△Ct法分析相对表达量。根据制造商的说明，采用ELISA法测定血浆心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)，CK-MB，hs-CRP和h-FABP。左室射血分数(LVEF)则采用2D二维超声心动图测量。Student t检验和Mann-Whitney U检验分别用来对比两组分类变量和连变量间的差异，多组间比较采用one way ANOVA或Kruskal-Wallis检验。Spearman等级相关分析用来描述两个变量的相关性。ROC曲线及曲线下面积(AUC)用来评价血清miR-208a和miR-208b诊断的意义:P《0.05认为具有统计学意义。
　　结果:
　　急性STEMI患者血浆中miR-208a、miR-208b表达水平显著高于健康对照组，分别为健康对照组的15.18倍(P＜0.001)和9.51倍(P＜0.001)。急性STEMI患者与健康对照组的miR-208a和miR-208b的ROC曲线有明显差异，曲线下面积(AUC)分别为0.955(95％可信区间0.912-0.999)，P=0.000和0.894(95％可信区间0.813-0.974)，P=0.000。这些心脏富集miR-208a、miR-208b的表达水平在UAP血浆中与健康对照组相比均略有上升，分别是健康对照组的5.39倍(P=0.000)和2.31倍(P=0.0009)。UAP患者与健康对照组的miR-208a和miR-208b的ROC曲线有明显差异，曲线下面积(AUC)分别为0.825，(95％CI0.702-0.948),P=0.000和0.705,(95％CI0.546-0.863),P=0.015。急性STEMI与UAP组的miR-208b表达水平之间有明显的统计学差异(P=0.047)。
　　cTnⅠ具有良好的准确性，以区分急性STEMI与UAP患者(曲线下面积AUC0.848，(95％CI0.743-0.954)，P=0.000。miR-208a与miR-208b的曲线下面积分别为0.659，(95％CI0.502-0.817)，P=0.040和0.695，(95％CI0.542-0.848)，P=0.012。急性STEMI发作后，上调的循环miR-208a和miR-208b水平在16.46±4.98小时后基本恢复到健康对照组水平(P＜0.05)。胸痛发作后，3个小时内入院的急性STEMI患者中，26/26(100％)的患者的miR-208a有上升，23/26(88.46％)的患者的miR-208b有上升，而仅有14/26(53.85％)的患者的cTnⅠ呈阳性。此外，循环miR-208a的表达与cTnⅠ呈正相关(P=0.027)。4/29(13.79％)的健康对照组的miR-208a呈假阳性，3/29(10.34％)的健康对照组的miR-208b呈假阳性，这表明，miR-208a与miR-208b的特异性分别为86.21％和89.66％。入院时，症状发作已超过3个小时以上的急性STEMI患者血浆中miR-208a、miR-208b以及cTnⅠ表达水平均有升高。以上数据显示，这些miRNAs对诊断AMI具有敏感性和特异性，提示miR-208a和miR-208b可以作为早期诊断AMI的生物标志物。
　　急性STEMI患者的h-FABP表达水平明显高于健康对照组P=0.002，与UAP患者相比P=0.600。h-FABP具有中等相关性，以区分AMI患者与健康对照组，曲线下面积AUC0.749(95％CI0.614-0.883)，P=0.002。h-FABP与miR-208a和miR-208b呈中等相关性(分别为rho=0.289，P=0.009和rho=0.320，P=0.003)。急性STEMI患者的血浆hs-CRP表达水平高于健康对照组(P=0.000)和UAP组(P=0，033)。UAP组的hs-CRP水平高于健康对照组，P=0.000。Hs-CRP可以很好的区分AMI患者与健康对照组，曲线下面积AUC of0.951(95％CI0.895-1.007)，P=0.000。miR-208a和miR-208b的表达与hs-CRP呈中等正相关性(分别为Spearman rho=0.287，P=0.013和rho=0.346，P=0.002)。另外，根据研究显示，急性STEMI患者血浆miR-208a、miR-208b分别与HDL呈负中等相关关系，分别为Spearman rho=-0.256，P=0.033和rho=-0.244,P=0.040.这两个miRNAs与血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和超低密度脂蛋白(VLDL)并无相关关系。并且，急性STEMI患者血浆miR-208a、miR-208b分别与左心室射血分数(LVEF)呈高度负相关关系，分别为rho=-0.602(P=0.000)和rho=-0.556(P=0.000)。
　　结论:
　　1、miR-208a、miR-208b表达水平在急性STEMI患者血浆中显著高于健康对照组。
　　2、循环心脏特异性miR-208a和miR-208b可能是潜在的早期、快速、准确诊断AMI的生物标志物。
　　3、血浆miR-208a和miR-208b的表达水平与炎症标志物hs-CRP和坏死标志物h-FABP有相关性。另外，还与LVEF和HDL存在相关性。
　　4、循环心脏特异性miR-208a和miR-208b可能是AMI的预测标志物。
　　5、这些miRNA可能从活体心肌细胞释放入血液循环，对心肌起保护作用。
　　6、需要由规模大、设计合理的规范化研究对循环miRNAs作为潜在的诊断和预后的急性心肌梗死生物标志物进行证明。
　　7、此外，需要了解miRNAs从心肌哪个部分，或者在什么条件下会释放入血液循环。

目录

声明

摘要

Abstract

Contents

Abbreviations

Introduction

Background

The aim of study

1．Methods

1．1 Study Population

1．2 Plasma collection and storage

1．3 Extraction of miRNA

1．4 Reverse transcription

1．5 RT-PCR

1．6 Laboratory assay

1．7 Statistical analysis

2 Results

2．1 Clinical characteristics of the study population

2．2 Plasma miR-208a and miR-208b elevated in patients with acute STEMI

2．3 Plasma miR-208a and miR-208b concentration and cTnI

2．4 Receiver operating characteristic(ROC)analysis

2．5 miRNAs and plasma levels of h-FABP in acute STEMI

2．6 miRNAs and plasma levels of hs-CRP in acute STEMI

2．7 Clinical correlations

2．7．1 Lipid profiles and cardiac specific miRNAs

2．7．2 miRNAs and Left ventricular systolic function

3．Discussion

3．1 Circulating miR-208a and miR-208b as biomarker in AMI

3．2 Circulating miR-208 correlations with LVEF and other biomarkers

3．3 Limitations

Conclussion

Papers innovations

Reference

Published papers

Literature review Acute myocardial infarction and miRNA 208

Acknowledgements