多糖水凝胶结合间充质干细胞治疗大鼠角膜碱烧伤的实验研究

摘要

研究目的：
　　本研究通过建立离体角膜上皮细胞（corneal epithelial cells，CECs）损伤模型和大鼠角膜碱烧伤的动物模型，利用局部应用多糖结合间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的联合疗法作用于两种模型，观察CECs的增殖和迁移变化和大鼠角膜碱烧伤损伤的修复过程，比较多糖结合MSCs的联合治疗与单独使用多糖及单独使用MSCs治疗效果的差异。探讨和评估联合多糖和MSCs治疗对大鼠角膜碱烧伤的疗效，为角膜碱烧伤的临床治疗提供一种全新的治疗策略。
　　1.多糖联合MSCs能否比单独使用多糖及单独使用MSCs治疗更能促进原代培养的CECs增殖和迁移。
　　2.多糖联合MSCs能否比单独使用多糖及单独使用MSCs治疗更能促进大鼠角膜碱烧伤后眼表的修复和重建。
　　研究方法：
　　1.培养大鼠原代CECs后，分别用多糖溶液、MSCs、多糖联合MSCs作用于CECs，并利用MTT法检测24h，48h，72h各浓度对原代培养CECs增殖能力的影响。
　　2.培养大鼠原代CECs后，建立离体上皮细胞损伤模型（细胞划痕实验），分别用多糖溶液、MSCs、多糖联合MSCs作用于CECs，并检测24h各组对原代培养的CECs迁移能力的影响。
　　3.建立大鼠角膜碱烧伤动物模型，分别用多糖水凝胶、MSCs、多糖水凝胶联合MSCs治疗角膜碱烧伤，分别于治疗后3d，7d，14d，28d观察和评估角膜透明度、角膜上皮愈合度、新生血管数量指标，并运用RT-PCR和ELISA方法检测各种治疗方法对大鼠角膜碱烧伤后角膜分泌的炎症相关因TNF-α、TGF-beta，趋化因子MIP-1α、MCP-1，新生血管相关因子VEGF、MMP-2、TSP-1变化的影响。
　　研究结果：
　　1.在多糖浓度＜200ug/ml时，各浓度多糖对CECs的增殖能力的差异没有统计学意义。在多糖浓度400ug/ml， CECs逐渐死亡。
　　2.细胞增殖实验显示，多糖组、MSCs组、多糖MSCs联合治疗组与对照组在24h,48h时对CECs的增殖能力的差异没有统计学意义，而MSCs组和多糖MSCs联合治疗组在72h时与对照组相比促进CECs增殖能力的差异具有统计学意义。
　　3.细胞划痕实验显示，多糖、MSCs组、多糖MSCs联合治疗组与对照组在24h促进CECs迁移能力差异均具有统计学意义，联合疗法与单治疗组促进CECs迁移的能力差异具有统计学意义。
　　4.多糖水凝胶应用于正常大鼠眼表未见明显的副反应存在。
　　5.大鼠角膜碱烧伤后，结膜下注射MSCs7天后可见MSCs大量存活，14天后仍可见少量存活。
　　6.动物模型实验发现，多糖组、MSCs组、多糖MSCs联合治疗组与未治疗组7天、14天、28天时提高角膜透明度差异均具有统计学意义，而联合治疗组与单治疗组相比提高角膜透明度的差异具有统计学意义。
　　7.动物模型实验发现，多糖组、MSCs组、多糖MSCs联合治疗组与未处理组在3天、7天、14天时促进上皮的愈合能力的差异均具有统计学意义，联合治疗组与单治疗组在7天、14天时促进角膜上皮愈合能力的差异具有统计学意义。
　　8.动物模型实验发现，多糖组、MSCs组、多糖MSCs联合治疗组与未处理组在7天、14天、28天时抑制新生血管能力的差异均具有统计学意义，联合治疗组与单治疗组在14天、28天时抑制新生血管能力的差异具有统计学意义。
　　9.大鼠角膜碱烧伤后各组角膜组织HE组织化学染色显示:MSCs组伤后第3天，第7天时，角膜上皮缺损区可见大疱状改变，胶原纤维排列疏松，可见上皮层及基质内炎症细胞浸润。第14天时角膜上皮愈合，基质水肿消失，可见基质内少量新生血管生成。多糖组伤后第3天，第7天时，角膜上皮缺损区未见大疱状病变，可见上皮层及基质内炎症细胞浸润。第14天时角膜上皮愈合，可见基质内新生血管生成。而联合治疗组第3天时，角膜上皮缺损区未见大疱状病变，可见极少量炎症细胞浸润。第7天时角膜上皮愈合。第14天时可见基质内极少量新生血管生成。
　　10.利用RT-PCR方法对大鼠角膜碱烧伤治疗后各组相关细胞因子的基因表达检测显示:多糖组、MSCs组、多糖MSCs联合治疗组与未处理组相比在各时间段下调TNF-α、MIP-1α、MCP-1，VEGF、MMP-2基因表达的差异均具有统计学意义，同时促进TSP-1、TGF-beta的表达上调的差异均具有统计学意义。多糖MSCs联合治疗与单治疗组相比下调TNF-α，MIP-1α、MCP-1及VEGF、MMP-2的基因表达的差异具有统计学意义，上调TGF-beta、TSP-1的基因表达差异具有统计学意义。
　　11.利用ELISA方法对大鼠角膜碱烧伤治疗后各组相关细胞因子蛋白表达检测显示:多糖组、MSCs组、多糖MSCs联合治疗组与未处理组相比减少VEGF蛋白表达、促进TGF-beta蛋白表达的差异具有统计学意义。而多糖MSCs联合治疗组与单治疗组相比减少VEGF蛋白表达，增加TGF-beta蛋白表达的差异具有统计学意义。
　　结论：
　　1.在多糖浓度＜200ug/ml时，在体及离体实验均表明，不同浓度多糖与CECs均具有良好的生物相容性。
　　2.200ug/ml多糖溶液对原代培养的CECs的形态和增殖没有影响，而MSCs在与CECs作用72h时能促进CECs的增殖。
　　3.多糖与MSCs均能促进CECs的24h迁移，而联合处理组具有更佳的促进效果。
　　4.原代培养的MSCs能在大鼠碱烧伤后的结膜下存活14天左右。
　　5.多糖和MSCs均能提高大鼠角膜碱烧伤后角膜透明度，促进角膜上皮的愈合，并抑制角膜新生血管的形成。而多糖MSCs联合治疗组提高角膜碱烧伤后角膜透明程度、角膜上皮愈合能力和抑制角膜新生血管的能力要显著优于MSCs或多糖单治疗组。
　　6.多糖和MSCs均能通过下调炎症因子TNF-α，趋化因子MIP-1α、MCP-1，新生血管因子VEGF、MMP-2的基因表达和VEGF蛋白表达，上调抗炎因子TGF-beta基因和蛋白表达、抗新生血管因子TSP-1的基因表达而达到抑制炎症反应和新生血管的作用。多糖MSCs联合治疗组抑制炎症反应和新生血管的作用要显著优于MSCs或多糖单治疗组。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、多糖溶液结合间充质干细胞对大鼠角膜上皮细胞生物学行为的影响

1．1 对象与方法

1．1．1 实验动物和实验仪器药品

1．1．2 实验方法

1．1．3 数据统计

1．2 结果

1．2．1 大鼠原代CECs培养

1．2．2 大鼠原代CECs CK-3免疫荧光染色鉴定

1．2．3 大鼠骨髓MSCs培养与鉴定

1．2．4 大鼠CECs与不同浓度多糖溶液的生物相容性

1．2．5 多糖及MSCs对大鼠CECs增殖的影响

1．2．6 多糖及MSCs对CECs迁移的影响

1．3 讨论

1．4 小结

二、多糖水凝胶结合MSCs对大鼠角膜碱烧伤治疗的研究

2．1 对象与方法

2．1．1 实验动物和实验仪器药品

2．1．2 实验方法

2．1．3 数据分析

2．2 结果

2．2．1 多糖水凝胶及其光谱图

2．2．2 多糖与正常大鼠角膜生物相容性

1．2．3 大鼠角膜碱烧伤后结膜下注射MSCs存活实验

2．2．4 大鼠碱烧伤模型的建立和多糖水凝胶眼表治疗

2．2．5 活体评价角膜碱烧伤治疗后效果

2．2．6 大鼠角膜碱烧伤后角膜组织学观察

2．2．7 RT-PCR检测大鼠角膜碱烧伤治疗后各组相关细胞因子的基因表达

2．2．8 ELISA检测大鼠角膜碱烧伤治疗后各组相关蛋白表达

2．3 讨论

2．4 小结

全文结论

创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 间充质干细胞及其分泌的细胞因子在眼科疾病中的研究进展

致谢