GLP-1类似物对高糖刺激的心肌细胞血管紧张素Ⅱ水平的影响及可能机制

摘要

目的:
　　心血管疾病作为糖尿病(DM)的主要并发症，是DM患者的主要死因。近年的研究表明，糖尿病心肌病(DCM)与DM患者心血管疾病的高发病率和高死亡率密切相关。过度激活的肾素血管紧张素系统(RAS)在DCM的发生、发展中起重要作用。有文献报道，高糖刺激能够激活磷酸化p-p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白以促进血管紧张素原(AGT)基因的表达。高糖状态下，局部RAS的主要效应成分血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)的表达明显增加，但p-p38MAPK与ANGⅡ之间是否具有关联尚不清楚。前期工作发现，胰高糖素样肽1(GLP-1)可显著改善糖尿病大鼠心肌的病理病变包括心肌细胞凋亡及心肌间质纤维化，而这些病理改变的发生、发展与心肌局部RAS的活性增高有着密切联系。研究发现Exendin-4（GLP-1受体激动剂）能够抑制脂毒性引起的p-p38MAPK的激活来保护内皮细胞。GLP-1是否能够抑制高糖状态下p38MAPK介导的心肌局部ANGⅡ的表达，来发挥心肌保护作用尚未见文献报道。故本研究拟以H9c2大鼠心肌细胞为研究对象，探讨在高糖状态下，p-p38MAPK蛋白在心肌局部ANGⅡ表达中的作用以及GLP-1类似物利拉鲁肽对ANGⅡ表达的影响，并初步探索p-p38MAPK在GLP-1影响心肌细胞ANGⅡ表达中所扮演的角色，从而为临床防治DCM、降低DM患者心血管疾病死亡率提高新的策略。
　　方法:
　　1.培养H9c2心肌细胞，分为低糖组（D-葡萄糖5.5mmol/L）、高糖组（D-葡萄糖25mmol/L）、高糖+p38MAPK抑制剂组(D-葡萄糖25mmol/L+S B20358010umol/L)、高渗组（D-葡萄糖5.5mmol/L+甘露醇19.5mmol/L），分别于0、12、24、48小时收集细胞，使用血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，ANGⅡ)ELISA试剂盒检测细胞上清液及裂解液中ANGⅡ浓度。
　　2.培养H9c2细胞，分为低糖组（NG组）、高糖组（HG组）、高糖+利拉鲁肽干预组（L10组:10nM利拉鲁肽;L100组:100nM利拉鲁肽;L1000组:1000nM利拉鲁肽），干预24小时后收集细胞，使用ANGⅡELISA试剂盒检测细胞上清及裂解液中ANGⅡ浓度。
　　3.培养H9c2心肌细胞，分为低糖组（A组）、高糖组（B组）、高糖+利拉鲁肽干预组（C组:100nM利拉鲁肽）、高糖+p38MAPK抑制剂(D组:SB20358010umol/L)，于24小时后收集细胞提取蛋白，用Western Blotting方法检测p-p38MAPK的蛋白表达。
　　结果:
　　1.高糖分别刺激H9c2大鼠心肌细胞12h、24h、48h。发现与低糖组相比，高糖刺激24h、48h后，细胞上清液及裂解液中ANGⅡ水平均显著升高(P＜0.01)，而高渗组细胞上清液及裂解液中ANGⅡ水平在12h、24h、48h均无显著差异(P＞0.05)。
　　2.与低糖组相比，高糖刺激24h后，心肌细胞p-p38MAPK蛋白表达显著增高(1.0900±0.04359vs0.6400±0.06254,P＜0.01)。
　　3.给予H9c2大鼠心肌细胞p38MAPK抑制剂SB203580预处理后，高糖分别干预12h、24h、48h。发现与高糖组相比，SB203580预处理后给予高糖干预24h、48h组细胞上清液及裂解液中ANGⅡ水平显著下降（P＜0.05）。
　　4.在高糖状态下，分别给予H9c2大鼠心肌细胞10nM、100nM、1000nM利拉鲁肽干预24h。发现与高糖组相比，利拉鲁肽干预后细胞裂解液中ANGⅡ水平均显著下降(P＜0.01)，但细胞上清液中ANGⅡ水平无明显差异(P＞0.05)。
　　5.在高糖状态下，给予H9c2大鼠心肌细胞100nM利拉鲁肽干预24h。结果发现与高糖组相比，利拉鲁肽干预后p-p38MAPK蛋白表达明显下降（0.5167±0.05686vs1.0900±0.04359，P＜0.01）;与SB203580干预后相比无明显差异（0.5167±0.05686vs0.0500±0.02828，P＞0.05）。
　　结论:
　　在高糖状态下，p38MAPK可介导心肌细胞ANGⅡ的表达。GLP-1类似物可抑制高糖状态下p38MAPK介导的心肌细胞ANGⅡ的表达。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象与方法

1．实验细胞培养

1．1 实验材料和主要试剂

1．2 实验方法

2．细胞上清及裂解液中ANGⅡ水平的测定

2．1 主要试剂及仪器

2．2 实验原理

2．3 细胞干预

2．4 标本采集

2．5 实验步骤

3．Western Blotting技术测定p-p38MAPK的表达

3．1 主要试剂及仪器

3．2 实验原理

3．3 H9c2大鼠心肌细胞的干预处理

3．4 实验步骤

4 统计学方法

结果

1 高糖状态下，p38MAPK在心肌细胞ANGⅡ表达中的作用

1．1 高糖干预后细胞上清液及裂解液中ANGⅡ水平的变化

1．2 给予p38MAPK抑制剂后细胞上清及裂解液中ANGⅡ水平

1．3 高糖干预后p-p38MAPK蛋白的表达

2 p-p38MAPK在GLP-1影响局部ANGⅡ表达中的作用

2．1 利拉鲁肽干预后细胞上清液及裂解液中ANGⅡ水平

2．2 利拉鲁肽干预后细胞p-p38MAPK蛋白的表达

讨论

1 糖尿病心肌病概述

2 RAS与DCM

2．1 RAS概述

2．2 ANGⅡ与心肌

2．3 糖尿病时局部RAS激活的可能机制

2．4 p38MAPK途径概述

3 GLP-1与RAS

3．1 GLP-1概述

3．2 GLP-1的心血管保护作用

3．3 GLP-1与心肌RAS的关系

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢

综述 局部肾素-血管紧张素系统与糖尿病心肌病关系的研究进展