GLP-1及其类似物对高糖环境下人脐静脉内皮细胞功能的保护作用及可能机制

摘要

目的：本课题拟探讨高糖诱导内皮细胞功能紊乱的机制，在进行高糖培养前用胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）及其受体激动剂Exendin-4预处理，观察其对高糖培养的原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）内皮功能紊乱的影响，并进一步探讨其与氧化应激、磷脂酰肌醇3-激酶/Akt（phosphatidyl inositol-3-kinase/Akt，PI3K/Akt）信号通路、乙二醛酶-1（glyoxalase–1，GLO-1）及糖基化终末产物（advanced glycation end-products，AGES）等的关系。
　　方法：（1）从健康孕妇剖宫产新生儿脐静脉中分离原代HUVECs，培养于含内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth supplement，ECGS）的M199培养基中，取生长状态良好的第3-5代细胞用于后续实验。实验分组：正常对照组（C组），不做任何处理；高糖处理组（HG组），30mMD-葡萄糖培养；GLP-1干预组（G+HG组），按HG组条件处理前按需加入GLP-1100nM预处理1 h；Exendin-4干预组（El+HG组及E2+HG组），按HG组条件处理前分别按需加入Exendin-4100nM或200nM干预1h。
　　（2）检测细胞上清中漏出的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）酶活性，进行细胞毒性作用定量分析。
　　（3）一氧化氮（nitric oxide，NO）荧光探针检测细胞内NO产量，Real Time PCR检测一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）mRNA表达水平，Western Blot检测eNOS蛋白表达水平，体现内皮细胞功能状态。
　　（4）检测细胞内活性氧族（reactive oxygen species，ROS）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力反映细胞内氧化应激状态，化学发光法检测细胞内ROS，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活力。
　　（5）利用细胞凋亡检测技术DAPI染核、FITC-PI双染流式细胞术、Western Blot检测Cleaved Caspase-3蛋白表达观察细胞凋亡情况。
　　（6）Real Time PCR检测GLO-1mRNA表达水平，Western Blot检测GLO-1蛋白表达水平，酶联免疫吸附试验ELISA法检测细胞上清及细胞内 GLO-1、AGES、糖基化终末产物受体（advanced glycation end-products receptor，RAGE）的含量。
　　（7）探讨GLP-1及Exendin-4对高糖下HUVECs功能的保护作用可能机制，Western Blo t检测p-Akt/Akt蛋白表达率的变化，反映细胞内PI3K/Akt信号通路的激活情况。
　　结果：实验结果显示，30mM高糖可诱导HUVECs细胞凋亡加速、NO生物利用下降，共同促成内皮细胞功能紊乱；高糖培养还可导致细胞内氧化应激状态、刺激AGES生成、下调GLO-1，进一步介导内皮损伤。GLP-1及Exendin-4对高糖环境下的HUVECs功能具有保护作用，具体表现如下：
　　（1）GLP-1及Exendin-4改善高糖环境对细胞的毒性作用，LDH法测得单独高糖处理组（HG组）LDH漏出量为对照组的181.07％±3.35%，G+HG组、E1+HG组及E2+HG组的LDH漏出量分别为对照组的134.94%±1.78%、136.56%±2.18%、134.74%±1.56%，P均小于0.01。
　　（2）GLP-1及Exendin-4促进高糖环境下细胞内NO生成。HG组细胞内NO荧光强度、细胞内eNOS mRNA及蛋白表达均降低；G+HG、E1+HG、E2+HG等组细胞内NO荧光强度较HG组升高约1倍（39.33±2.49、40.31±2.22、39.90±2.22 vs19.21±1.10，P＜0.01），细胞内eNOS mRNA（104.01%±4.72%、101.95%±5.35%、105.16%±5.95%vs48.16%±2.54%，P＜0.01）、蛋白表达（0.71±0.01、0.72±0.01、0.72±0.02 vs0.56±0.01，P＜0.01）均上调。
　　（3）GLP-1及Exe nd in-4可改善高糖环境下细胞内氧化应激状态。30 mM D-葡萄糖处理7天HUVECs细胞内ROS荧光强度增强一倍以上（300.00±4.73 vs137.58±7.37，P＜0.01）；G+HG、E1+HG和E2+HG等组细胞内ROS荧光强度分别为156.68±9.40、158.14±11.05、156.52±9.73，各组ROS产生可抑制至对照组水平（P＜0.01）；SOD活力分别为39.20±2.21 U/mgpro te in、38.17±1.59 U/mgp rote in、39.44±2.65 U/mgpro te in，SOD活力较HG组提高了65%（P＜0.01）。
　　（5）30mMD-葡萄糖处理引起内皮细胞凋亡加速，GLP-1及Exendin-4干预使细胞凋亡形态明显改善，DAPI染核计数凋亡细胞数减少，流式细胞术测得细胞凋亡率降低（28.28±2.06%、28.64±1.83%、28.60±1.86%vs39.13±1.53%，P＜0.01），同时Cleaved Caspase-3蛋白表达下调（0.33±0.02、0.32±0.02、0.32±0.02 vs0.3842±0.01155，P＜0.01）。
　　（6）GLP-1及Exendin-4可能具有调节与糖基化作用相关的GLO-1和AGES的作用。HG组细胞内GLO-1蛋白表达下调，细胞膜RAGE受体表达上调，细胞上清中AGES释放增加；G+HG、E1+HG、E2+HG等组细胞内GLO-1表达较HG组上调（ELISA法：2.34±0.17ng/mgprotein、2.35±0.17ng/mgprotein、2.31±0.16ng/mgprotein vs1.51±0.11ng/mgproteinein，P＜0.01），GLO-1 mRNA表达也增加，而细胞上清中AGES产生减少（1472±142.2ng/ml、1515±103.6 ng/ml、1426±124.4ng/ml vs2042±121.9ng/ml P＜0.01）。
　　（6）GLP-1及Exendin-4对高糖环境下HUVECs功能的保护可能与激活了PI3K-AKT信号通路有关，P-Akt磷酸化表达增加。
　　结论：高糖培养HUVECs可诱导内皮细胞功能障碍，而Exendin-4及GLP-1能够改善内皮细胞功能紊乱，其机制可能涉及改善HUVECs细胞内氧化应激，PI3K-AKT信号通路的激活，调节GLO-1代谢AGES过程等有关。

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前言

材料与方法

1材料

2 方法

3 统计学处理

结果

1 HUVECs培养及鉴定

2 GLP-1及Exe ndin-4可降低高糖环境对HUVECs的毒性作用：

3 GLP-1及不同浓度Exe ndin-4可改善高糖下HUVECs细胞功能状态

4 GLP-1及不同浓度Exe ndin-4对高糖环境下的HUVECs内氧化应激指标的影响：

5 GLP-1及Exe ndin-4可抑制高糖诱导的HUVECs凋亡：

6 GLP-1及Exendin-4对高糖下HUVECsAGES形成代谢的影响

7 GLP-1及Exe ndin-4对高糖下PI3K/Akt信号通路的影响

讨论

结论

参考文献

致谢

综述

参考文献