雷帕霉素经JAK2/STAT3通路诱导HGF处理的人晶状体上皮细胞凋亡的研究

摘要

目的:通过人肝细胞生长因子（hepatocyte growth gactor，HGF）处理人晶状体上皮细胞株HLE-B3，体外模拟后发性白内障（posterior capsule opacity，PCO）发生时晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)所处的微环境，并用不同浓度的雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）刺激HLE-B3，观察RAPA对HLE-B3增生、凋亡的影响，探讨RAPA影响HLE-B3的生长作用的分子机制。
　　方法:
　　1.培养HLE-B3:用含有10％ FBS、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的低糖DMEM体外培养HLE-B3，并进行传代。
　　2.实验分组:常规培养HLE-B3细胞系，生长至80％融合后，换用无血清DMEM培养基，分组如下:
　　空白对照组:仅加入单纯DMEM，不加入RAPA或人HGF处理;
　　阴性对照组（HGF组）:加入终浓度为10ng/ml的人HGF;
　　HGF+RAPA组:用终浓度为10ng/ml的HGF处理LECs12h后，加入不同浓度的RAPA（A组:0.1 ng/ml、B组:1ng/ml、C组:5ng/ml、D组10 ng/ml、E组20 ng/ml）干预24、48、72小时。
　　3.通过CCK-8法检测RAPA对人HGF预处理的LECs(HGF(+)LECs)细胞增殖活力的影响。
　　4.运用苏木精—伊红染色观察RAPA对HGF(+)LECs细胞形态结构的影响。
　　5.RAPA处理细胞48h后，采用LIVE/DEAD细胞活性实验及AnnexinⅤ/PI双染色流式法检测RAPA对HGF(+)LECs细胞凋亡的作用。
　　6.运用蛋白印迹(Western blot)分析检测研究0ng/ml、5ng/ml RAPA处理HGF(+)LECs48h后，RAPA对HLE-B3细胞的酪氨酸激酶JAK2(Januskinase-2)、信号转导和转录活化因子3(Signal transducer and activator oftranscription-3，STAT3)蛋白磷酸化的作用。
　　7.用Lipofectamine2000作为转染试剂，将STAT3 siRNA或者阴性对照siRNA转染到HLE-B3中，然后用终浓度浓度为10ng/ml的人HGF处理12h，再加入终浓度为5ng/ml的RAPA处理12h。用Western blot和细胞凋亡ELISA法，观察STAT3表达抑制在RAPA对HGF(+)LECs细胞凋亡中的作用。细胞分组为:A组:阴性siRNA转染组、HGF10ng/ml处理组;B组:阴性siRNA转染组、HGF10ng/ml和RAPA5ng/ml处理组;C组为:STAT3 siRNA转染、HGF10ng/m处理组;D组:STAT3 siRNA转染、HGF10ng/ml和RAPA5ng/ml处理组。
　　结果:
　　1.RAPA对HGF(+) LECs细胞增殖的影响
　　CCK-8:测得的HGF组增生值（A），与相应时段的对照组相比，差异均有统计学意义（P1=0.022，P2=0.00，P3=0.00），提示10ng/ml人HGF能有效促进LECs增殖。在HGF+RAPA组中，运用Probit回归分析法得出:24hIC50=30.38ng/ml，48h IC50=15.820ng/ml，72h IC50=6.247ng/ml。随着RAPA药物浓度的升高，刺激时间的延长，A值逐渐降低，同时细胞生长抑制率逐渐升高。
　　HE显示:HGF组(RAPA0ng/ml)，其细胞体积较大、而且饱满，细胞质染色均匀，细胞核呈圆形。HGF+RAPA组细胞表现出体积变小，染色质边集，核深染、固缩等特征性调亡改变，且随着浓度的增加，及培养时间的增长，细胞这种形态变化越明显，且细胞数越少。
　　2.RAPA对HGF(+) LECs细胞凋亡的影响
　　Live/Dead荧光双染色法显示:HGF+RAPA组(5ng/ml、10ng/ml)细胞死亡率分别为（18.89±2.89）％、（32.61±2.41）％，与HGF组（2.50±0.90）％相比，差异均具有统计学意义(P=0.001、0.00)。
　　AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞术显示:细胞凋亡的比率随RAPA浓度的增加而增高，细胞总凋亡率(Q2+Q3)分别为（25.03±1.68）％、（63.27±4.78）％、（72.17±3.97）％（HGF+RAPA1ng/m、5ng/m、10ng/m组），与HGF组(2.48±0.45)％相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这些数据表明，RAPA不仅抑制HGF(+)LECs的增殖，而且还诱导了LECs的凋亡。
　　3.JAK2/STAT3信号通路在RAPA对HGF(+) LECs细胞凋亡中的作用
　　RAPA处理后，p-JAK2、p-STAT3Tyr705及p-STAT3Ser727蛋白相对表达量显著下降（P=0.001，0.00，0.00＜0.05），分别是相应对照组的0.28、0.14、0.13倍。
　　用siRNA沉默HLE-B3细胞STAT3基因后，与转染阴性组相比，STAT3 siRNA转染到LECs细胞导致STAT3蛋白表达显著下降。与A组(0.28±0.05)相比，B组（1.64±0.06）、C组(2.09±0.07)、D组(2.57±0.08)凋亡增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.人HGF能有效促进HLE-B3增生，可以体外模拟PCO发生的微环境。
　　2.RAPA不仅抑制HGF(+)LECs的增殖，还诱导了LECs的凋亡，这种作用且呈时间及浓度依赖性。
　　3.RAPA可以显著降低HGF(+)LECs细胞中JAK2及其下游基因STAT3的磷酸化。沉默STAT3加速了HGF(+)LECs的凋亡，表明STAT3基因在LECs细胞凋亡中发挥重要作用;此外，相较于单独转染STAT3 siRNA处理细胞，与RAPA联合处理可以增加HGF(+) LECs的凋亡。
　　综上，RAPA可以通过下调JAK2/STAT3信号通路抑制HGF(+) LECs的增殖以及诱导HGF(+)LECs凋亡。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

实验材料和方法

1．实验材料

1．1 实验细胞

1．2 主要试剂及溶液配制

1．3 主要实验器材及仪器

2．实验方法

2．1 人晶状体上皮细胞株HLE-B3的培养

2．2 制作HLE-B3细胞爬片

2．3 实验分组

2．4 细胞增殖活力检测

2．5 HLE-B3细胞病理形态学观察

2．6 LIVE／DEAD细胞活性检测

2．7 Annexin V-FITC／PI双染法流式细胞术

2．8 RNA干扰和瞬时转染

2．9 蛋白印迹分析

2．10 细胞凋亡ELISA检测

3．统计学方法

结果

1．RAPA对HGF(+)LECs细胞增殖的影响

1．1 细胞增殖活力检测

1．2 HLE-B3细胞病理形态学观察

2．RAPA对NSF(+)LECs细胞凋亡的影响

2．1 LIVE／DEAD细胞活性检测

2．2 Annexin V-FITC／PI双染法流式细胞术细胞调亡检测

3．JAK2／STAT3信号通路在RAPA对HGF(+)LECs细胞凋亡中的作用

3．1 Western blot

3．2 细胞凋亡ELISA检测

讨论

1．RAPA对HGF(+)LECs细胞增生的影响

2．RAPA对HGF(+)LECs细胞凋亡的影响

3．JAK2／STAT3信号通路在RAPA诱导HGF(+)LECs细胞凋亡中的作用

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 RAPA在眼科领域的研究进展

致谢