缺氧影响胃腺癌循环肿瘤细胞发生的体内实验研究

摘要

目的:
　　本实验第一部分通过体外培养肿瘤细胞加标回收实验(spike recovery)来评价应用密度梯度离心法联合CK19细胞免疫荧光法进行循环肿瘤细胞(circulationtumor cells，CTCs)富集/鉴定的回收率、特异性及敏感性;第二部分探讨微环境缺氧的变化与胃腺癌循环肿瘤细胞发生之间的相关性。
　　方法:
　　1、应用体外培养细胞加标回收实验(spike recovery)来评价CTCs富集、鉴定的回收率、特异性及敏感性:即常规培养人低分化胃腺癌BGC-823细胞，于显微镜下利用无菌PBS调整细胞浓度至100个/ml，加此细胞悬液100 ul至10 ml健康志愿者血液中（每份血液含人低分化胃腺癌BGC-823细胞数为10个），采用密度梯度离心法富集CTCs，以抗角化蛋白(CK19)为标记物行细胞免疫荧光鉴定并计数CTCs，分别对健康志愿者及胃癌患者外周血CTCs进行富集及鉴定，通过两组差异来评价该方法的回收率、特异性及敏感性。
　　2、人低分化胃腺癌BGC-823细胞经不同终浓度CoCl2(0、100、200、300、400 umol/L)处理4h后，应用Western Blot检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)表达水平来筛选最适浓度。
　　3、将60只BALB/C小鼠随机分为三组:缺氧组，常氧组、对照组（生理盐水），每组20只，采用终浓度200 umol/L CoCl2处理BGC-823细胞4h组作为缺氧组，无血清培养基处理BGC-823细胞4h组作为常氧组，鼠尾静脉注射上述处理胃癌细胞，注射成功3天后，内眦静脉采血1ml于EDTA抗凝管中，用上述方法进行CTCs富集、鉴定及计数。
　　结果:
　　1、培养细胞加标回收实验显示该方法的平均回收率为75％;10名健康志愿者血液均无CTCs检出，而20名胃癌患者中，CTCs数目为0者占所检测患者的40％，CTCs数目大于1个者占所检测患者的60％，即CTCs阳性检出率为60％。
　　2、BGC-823细胞经终浓度200 umol/L CoCl2模拟缺氧4h后HIF-1α表达水平最高，与其他不同终浓度处理的细胞相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、CTCs发生与缺氧明显相关，缺氧组小鼠CTCs检出数量较常氧组增高(4.70±1.86 vs1.15±0.67, P=0.000)。
　　结论:
　　1、基于密度梯度离心法、CK19细胞免疫荧光法的循环肿瘤细胞富集/鉴定方法具有较好的回收率，且对于CTCs的临床诊断具有较好的特异性和敏感性。
　　2、微环境缺氧可能促进胃腺癌CTCs的发生。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

流程图

一、基于密度梯度离心法、CK19细胞免疫荧光法的CTCs富集／鉴定方法

1．1 对象和方法

1．1．1 研究对象

1．1．2 主要仪器设备

1．1．3 主要试剂

1．1．4 主要试剂溶液的配制

1．1．5 实验方法

1．1．6 结果判定

1．1．7 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 体外培养细胞加标回收实验的免疫荧光染色结果及回收率(100X)

1．2．2 健康志愿者和胃癌患者CTCs检测结果(100X)

1．3 讨论

1．4 小结

二、微环境缺氧与胃腺癌CTCs发生的相关性研究

2．1 对象与方法

2．1．1 研究对象

2．1．2 实验材料

2．1．3 主要试剂溶液配制

2．1．4 实验方法

2．1．5 结果判定

2．1．6 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 Western Blot检测不同终浓度CoCl2诱导BGC-823缺氧的HIF-1α表达水平

2．2．2 各组BALB／C小鼠内眦血中CTCs检测结果

2．3 讨论

2．4 小结

结论

参考文献

在学期间发表论文

综述 循环肿瘤细胞与肿瘤干细胞相关性研究进展

致谢