γδT细胞在小鼠沙眼衣原体呼吸道感染中的保护作用及机制

摘要

衣原体(chlamydia)是一类严格的细胞内寄生菌，沙眼衣原体（Chlamydia trach omatis，Ct）是引起人类疾病的主要衣原体菌株，可引起沙眼、肺炎及性传播疾病，通过性接触传播引起泌尿生殖系统炎症，并可继发不孕、不育等并发症，对人类健康危害极大。由于对这一胞内寄生菌诱导的复杂的宿主免疫反应机制缺乏更全面、细致的了解，目前尚没有有效的疫苗用于衣原体感染的预防。对衣原体感染宿主免疫保护机制的深入研究对有效预防和临床治疗衣原体感染疾病有十分重要的意义。前期的研究已证实，αβT细胞介导的细胞免疫应答，尤其是CD3+CD4+T细胞分泌的IFNγ和IL-17在宿主抗衣原体感染中发挥重要保护作用。γδT细胞是参与先天性免疫应答的细胞，活化后分泌IFN-γ、GM-CSF等细胞因子，调节其它免疫细胞功能，桥联先天性和获得性免疫。γδT细胞在感染早期能够产生大量的IL-17A介导疾病的发生发展，这一功能日益受到关注。
　　目的：
　　利用沙眼衣原体小鼠肺炎菌株（Cm）呼吸道感染模型探讨γδT细胞在沙眼衣原体呼吸道感染中的增殖、活化及细胞因子的产生；利用γδT细胞基因敲除小鼠探讨γδT细胞在沙眼衣原体呼吸道感染中的作用以及对衣原体特异性的适应性免疫应答的调节。
　　方法：
　　WT小鼠（C57BL/6鼠）鼻腔吸入1×103 IFU沙眼衣原体小鼠肺炎菌株（Cm），建立小鼠沙眼衣原体肺炎模型。为了确定γδT细胞的增殖、活化及细胞因子分泌，在Cm感染的不同时间点处死小鼠，分离小鼠脾及肺组织单个核细胞，用荧光标记的抗鼠CD3、TCRγδ及CD69抗体染色，流式细胞仪检测WT小鼠肺及脾组织CD3+TCRγδ+T细胞百分率及细胞数，确定Cm感染诱导γδT细胞的增殖；检测CD3+TCRγδ+T细胞表面CD69表达水平，确定Cm感染诱导γδT细胞的活化；利用细胞内细胞因子染色技术检测Cm感染不同时间点肺组织CD3+TCRγδ+T细胞细胞因子IFNγ和IL-17的分泌水平。为了进一步确定γδT在衣原体肺炎中的作用，用上述方法分别感染WT小鼠（C57BL/6）和TCRδ-/-小鼠（C57BL/6γδT KO鼠），每天监测两种小鼠体重变化；制备感染后不同时间点小鼠肺组织匀浆，体外感染Hep2细胞，用酶免疫法染色衣原体包涵体，计数包涵体形成单位（IFU）以确定感染小鼠肺组织衣原体繁殖水平；感染小鼠肺组织进行H&E染色确定Cm感染诱导的肺组织炎症。为了确定γδT细胞对宿主抗衣原体特异性免疫应答的影响，用ELISA法测定脾脏单个核细胞培养上清中IFNγ、IL-4及IL-17的产生；进一步采用细胞内细胞因子染色技术测定小鼠肺组织中CD3+CD4+T细胞IFNγ（Th1免疫应答）、CD3+CD4+T细胞IL-4（Th2免疫应答）及CD3+CD4+T细胞IL-17（Th17免疫应答）水平，确定γδT细胞对宿主抗衣原体Th1、Th2、Th17免疫应答的调节作用。
　　结果：
　　一定剂量的Cm经呼吸道感染诱导小鼠衣原体肺炎。与未感染的对照组（第0天）比较，Cm感染诱导小鼠肺及脾组织CD3+TCRγδ+T细胞百分率及肺组织γδT细胞总数逐渐升高，于感染后第7天达到高峰，随后逐渐下降。肺组织CD3+TCRγδ+T细胞表面活化标志分子CD69检测结果显示，与未感染组相比，CD69表达于感染后第3天达到高峰，此后略有降低。以上结果提示，Cm呼吸道感染诱导γδT细胞在感染部位及外周免疫器官聚集及活化。进一步对γδT细胞产生的细胞因子进行检测，结果显示Cm感染诱导γδT细胞分泌大量IFNγ、IL-17，与未感染对照组相比，Cm感染后第3天，γδT细胞产生IFNγ、IL-17达到高峰，与αβT细胞分泌IL-17、IFNγ水平比较，γδT细胞主要在Cm感染早期（感染后前3天）分泌大量IFNγ和IL-17。我们用TCRδ-/-小鼠确定γδT细胞在Cm呼吸道感染中的作用。与WT小鼠比较，TCRδ-/-小鼠Cm感染后体重下降更为显著，肺组织病理较重但两组小鼠肺组织沙眼衣原体繁殖水平未见显著差异，提示γδT细胞在Cm呼吸道感染中发挥一定的免疫保护作用。对γδT细胞抗衣原体感染免疫保护机制进行探讨，WT与TCRδ-/-小鼠在Cm呼吸道感染后的第3天和第7天脾细胞培养上清中IFNγ、IL-4分泌无显著差异但TCRδ-/-小鼠IL-17分泌显著低于WT鼠，细胞内细胞因子染色小鼠肺组织单个核细胞CD3+CD4+T IFNγ、CD3+CD4+T IL-4及CD3+CD4+T IL-17水平，结果显示，TCRδ-/-小鼠在感染的第3天和第7天CD3+CD4+T细胞IL-17的产生显著低于WT鼠，但CD3+CD4+T IFNγ和IL-4产生未见显著差异。
　　结论:
　　Cm呼吸道感染诱导γδT细胞在感染局部及外周免疫器官大量聚集及活化，活化的γδT细胞通过分泌IFNγ和IL-17，参与宿主抗衣原体免疫应答。γδT细胞在宿主抵抗Cm呼吸道感染中通过促进抗衣原体特异性的Th17免疫应答发挥一定的免疫保护作用。

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符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

材料与方法

1.实验材料

1.1主要仪器和设备

1.2主要试剂

1.3 主要试剂的配制

1.4 实验菌种

1.5 实验动物

2. 实验方法

2.1 沙眼衣原体的繁殖及鉴定

2.2感染动物

2.3肺组织上清液中衣原体活性测定

2.4肺组织病理学染色

2.5小鼠肺组织单个核细胞的制备

2.6 小鼠脾组织单个核细胞的制备

2.7肺和脾脏单个核细胞染色

2.8细胞因子ELISA检测

2.9 统计分析

结果

1.γδT细胞参与宿主抗衣原体感染免疫应答

1.1沙眼衣原体呼吸道感染诱导γδT细胞在小鼠肺组织内增殖和活化

1.2沙眼衣原体呼吸道感染诱导γδT细胞在小鼠脾脏增殖

1.3沙眼衣原体呼吸道感染诱导γδT细胞分泌细胞因子

1.4与αβT细胞比较γδT细胞是沙眼衣原体呼吸道感染早期IFNγ和IL-17的产生的主要细胞

1.5小结

2. γδT细胞在沙眼衣原体呼吸道感染早期发挥免疫保护作用

2.1沙眼衣原体呼吸道感染早期TCRδ-/-小鼠体重显著降低

2.2 沙眼衣原体呼吸道感染后TCRδ-/-小鼠肺组织大量衣原体繁殖

2.3 沙眼衣原体呼吸道感染后TCRδ-/-小鼠肺组织炎症较重

2.4小结

3.γδT细胞在沙眼衣原体呼吸道感染中对适应性免疫应答的调节

3.1 γδT细胞对Th1免疫应答的调节作用

3.2 γδT细胞对Th2免疫应答的调节作用

3.3 γδT细胞对Th17免疫应答的调节作用

3.4小结

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 在感染性疾病中γδT细胞对其它固有细胞的调节作用

致谢