在癫痫神经元中miR-132调控BDNF-TrkB信号通路表达的研究

摘要

目的：颞叶癫痫是最常见的癫痫类型，且绝大多数是药物难治性癫痫，其发病机制尚不十分清楚。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)促进了神经元的存活、生长发育及分化等过程。其生物学功能主要通过特异性受体酪氨酸激酶B（tyrosine kinase receptor B, TrkB）介导而实现。近来研究表明BDNF-TrkB信号通路在癫痫的发生与发展过程中起着关键作用。微小RNA(microRNA)是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA。现已被证实其在多种神经系统疾病中发挥着重要功能。研究发现miR-132在癫痫发病过程中发挥了重要作用，但具体机制有待研究。本课题旨在通过检测转染miR-132后的海马神经元癫痫模型中TrkB蛋白磷酸化水平的变化，来了解其对BDNF-TrkB信号通路的调控作用，并探讨其在癫痫发病中的作用。
　　方法：制备miR-132慢病毒表达载体。采用24小时内新生Sprague Dawley（SD）大鼠，取海马神经元体外原代培养7天。采用完全随机化方法将细胞分为①正常组、②癫痫组、③正常+BDNF组、④癫痫+BDNF组、⑤正常+miR-132组、⑥癫痫+miR-132组、⑦正常+BDNF+miR-132组、⑧癫痫+BDNF+miR-132组。利用膜片钳技术检测海马神经元放电情况，荧光定量PCR法检测海马神经元中miR-132的表达情况，利用免疫印迹技术检测海马神经元中TrkB和p-TrkB蛋白的表达情况，Quantity one软件对TrkB及p-TrkB的灰度值进行分析，p-TrkB与TrkB的比值表示BDNF-TrkB通路的激活状态。方差分析进行统计学分析，检验水准a=0.05，数据使用SPSS19.0统计软件包进行分析，p≤0.05为有统计学意义。
　　癫痫模型的制备方法是：细胞培养至第7d时，用“无镁”细胞外液处理3h，建立大鼠海马神经元癫痫模型。
　　转染miR-132组的处理方法是：培养至第7d时加入miR-132慢病毒稀释液，24h后换成完全培养液继续培养24小时。
　　加入BDNF组的处理方法是：于提取蛋白前10min在培养液中加入BDNF。
　　结果：
　　1、膜片钳技术检测海马神经元痫样放电：
　　与正常组相比，体外培养7d后的癫痫模型组大鼠海马神经元自发性放电频率明显增加（p=0.001）。
　　2、荧光定量PCR法检测miR-132表达示：与正常组相比，癫痫组miR-132表达明显增加，差异有统计学意义（p＜0.001）。
　　3、蛋白免疫印迹结果显示：
　　⑴与癫痫组相比，正常组 p-TrkB/TrkB值较高，差异有统计学意义（p=0.008）；
　　⑵与正常组和相比，正常+BDNF组 p-TrkB/TrkB值升高，差异有统计学意义（p=0.015）；
　　⑶与癫痫组相比，癫痫+BDNF组 p-TrkB/TrkB值升高，差异有统计学意义(p=0.012)；
　　⑷与癫痫+miR-132组相比，癫痫组p-TrkB/TrkB值较高（p=0.004），癫痫+BDNF+miR-132组p-TrkB/TrkB值较高（p=0.030）。
　　4、结果提示：加入外源性BDNF后，正常组和癫痫组的p-TrkB/TrkB值均明显升高。说明外源性 BDNF可以激活 BDNF/TrkB通路，而加入miR-132后，癫痫组和癫痫+BDNF组的p-TrkB/TrkB值均有所降低
　　结论：
　　1.癫痫状态下，海马神经元miR-132表达增高。
　　2.加入外源性BDNF后，正常组和癫痫组的p-TrkB/TrkB值均明显升高。说明外源性BDNF可以激活BDNF/TrkB通路。
　　3.正常组比癫痫组的p-TrkB/TrkB值高，说明BDNF-TrkB信号通路在癫痫状态下处于受抑制状态。
　　4.癫痫神经元转染miR-132后，p-TrkB/TrkB值均有所下降，说明海马神经元转染miR-132后，抑制了BDNF-TrkB信号通路。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1对象和方法

1.1 研究对象：

1.2 主要试剂及设备：

1.2.1实验试剂

1.2.2 实验设备

1.2.3主要溶液及试剂配方

1.3 实验方法：

1.3.1海马神经元原代培养

1.3.2海马神经元癫痫模型的建立

1.3.3建立miR-132慢病毒表达载体

1.3.4实验分组

1.3.5 荧光定量PCR法检测正常组及癫痫组中miR-132的表达

1.3.6总蛋白的提取及总蛋白浓度测定

1.3.7免疫印迹（Western Blot法）检测蛋白

1.4 统计学分析

2结果

2.1 正常组及癫痫组miR-132表达情况

2.2膜片钳技术鉴定细胞痫样放电结果

2.3建立miR-132慢病毒表达载体结果

2.4Westem Blot实验结果

2.4.1利用Westem Blot技术对八组海马神经元中p-TrkB、TrkB及内参β-Actin蛋白进行检测

2.4.2分别对各组蛋白灰度值进行统计分析后显示：

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: MicroRNA在癫痫疾病中的调控作用

致谢