吡非尼酮抑制眼眶成纤维细胞应力纤维及粘着斑重构作用和细胞功能的实验研究

摘要

第一部分：眼外肌来源成纤维细胞的原代培养、鉴定及诱导分化
　　目的：研究TAO眼外肌来源的成纤维细胞，在TGF-β1作用下的细胞生长分化状态。
　　方法：通过组织块培养法收集TAO眼外肌来源的成纤维细胞，进行细胞形态及免疫标记物鉴定为成纤维细胞；通过MTT法观察成纤维细胞在不同浓度TGF-β1（1μg/L、5μg/L、10μg/L）诱导后的增殖效应；通过免疫细胞化学法检测成纤维细胞表达α-SMA；通过Western检测不同浓度（1μg/L、5μg/L、10μg/L）和时间（24h、48h、72h）效应下，TGF-β1诱导成纤维细胞表达α-SMA水平。
　　结果：⑴原代和传代培养的细胞呈长梭形，胞浆丰满，核呈圆形或椭圆形，核仁清晰，细胞融合后呈放射状、漩涡状排列紧密；免疫细胞化学染色显示：vimentin阳性表达，Desmin、Kerati、S-100、第Ⅷ因子呈阴性反应，可以鉴定TAO组和正常对照组眼外肌标本培养的细胞为成纤维细胞。⑵MTT法检测TGF-β1诱导72h后的成纤维细胞增殖率具有剂量效应，10μg/L TGF-β1组细胞增殖率最高，为107.35％（P﹤0.05）；TAO组和正常对照组的成纤维细胞MTT光密度值比较，差别不具有统计学意义（P﹥0.05）。⑶10μg/L TGF-β1处理24h，成纤维细胞胞浆丰满，体型增大，细胞足突增多；免疫细胞化学染色显示胞浆内大量α-SMA表达，强阳性染色；阴性处理组细胞内表达α-SMA量少。⑷Western-blot检测TGF-β1诱导成纤维细胞表达α-SMA蛋白具有剂量和时间效应，10μg/L TGF-β1处理48h具有最大表达量（P﹤0.05）；TAO组和正常对照组的成纤维细胞α-SMA蛋白表达量相互比较，差别不具有统计学意义（P﹥0.05）。
　　结论：利用组织块贴壁法培养的成纤维细胞的形态学和免疫学特征明显，可用于甲状腺相关眼病的体外研究对象。TGF-β1具有促进成纤维细胞增殖和向肌纤维母细胞分化作用，其诱导的α-SMA表达水平增高在一定范围内具有浓度和时间依赖性。
　　第二部分：吡非尼酮抑制成纤维细胞增殖、分化、迁移及收缩功能的实验研究
　　目的：研究吡非尼酮对TAO眼外肌成纤维细胞的增殖、分化、迁移和收缩胶原作用的影响。
　　方法：在不同浓度TGF-β1、吡非尼酮、地塞米松作用下，通过MTT法检测成纤维细胞增殖作用，台盼蓝染色法检测细胞存活状态。在10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml吡非尼酮、1000nM地塞米松作用下，利用划痕实验检测细胞迁移作用，免疫细胞化学法检测细胞表达α-SMA、fibronectin的作用，以及凝胶收缩实验检测细胞收缩胶原的作用。
　　结果：⑴MTT法检测吡非尼酮抑制成纤维细胞增殖率具有剂量效应，0.5mg/ml、1.0mg/ml吡非尼酮的72h细胞增殖率，分别为-24.82%、-41.84%，二者MTT值与空白对照组比较，P﹤0.05；吡非尼酮较地塞米松具有更强的抑制 TGF-β1诱导的细胞增殖作用（P﹤0.05）。⑵台盼蓝染色法观察不同浓度吡非尼酮作用72h后，成纤维细胞活性良好，未见明显细胞毒性作用。⑶细胞划痕实验显示，TGF-β1具有促进细胞迁移和融合效应；吡非尼酮抑制细胞迁移作用明显（P﹤0.05）。⑷免疫细胞化学染色显示，吡非尼酮作用72h后成纤维细胞内无明显α-SMA表达；地塞米松组成纤维细胞内正常表达α-SMA。空白对照组、TGF-β1组、地塞米松组72h后均可见fibronectin在成纤维细胞内外高表达，并聚合成互相连接的纤维网状结构；吡非尼酮组、吡非尼酮联合TGF-β1组72h后fibronectin表达被抑制。⑸凝胶收缩实验显示，连续观察6天后，TGF-β1组的收缩指数为59.38%，与空白对照组比较，显示强大的促进成纤维细胞介导的胶原收缩作用（P﹤0.05）；吡非尼酮组、吡非尼酮联合TGF-β1组的收缩指数分别为6.70%和8.02%，具有明显抑制成纤维细胞介导的胶原收缩作用（P﹤0.05）；地塞米松组收缩指数25.48%，与空白对照组比较无统计学意义（P﹥0.05）。
　　结论：吡非尼酮可抑制体外培养眼眶成纤维细胞的增殖和向肌纤维母细胞表型分化；抑制成纤维细胞/肌纤维母细胞的迁移和胶原收缩作用；并且对fibronectin的表达也有明显的下调作用。吡非尼酮较地塞米松具有更强的抑制TGF-β1介导的成纤维细胞增殖、分化、迁移和胶原收缩作用。
　　第三部分:吡非尼酮抑制眼眶成纤维细胞应力纤维重构及粘着斑成熟作用的实验研究
　　目的：研究吡非尼酮对TGF-β1诱导下的TAO眼外肌成纤维细胞的肌动蛋白应力纤维构建和粘着斑成熟分化的作用，以及相关信号通路的影响。
　　方法：在10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml吡非尼酮作用下，利用免疫荧光技术和共聚焦激光扫描显微镜观察肌动蛋白应力纤维、粘着斑蛋白和Ⅰ型胶原形态及细胞定位，Western-blot检测Akt、Phospho-Akt、FAK、Phospho-FAK蛋白的表达，以及通过MaxGelTM检测成纤维细胞在细胞外基质中的粘附作用。
　　结果：⑴共聚焦显微镜下观察，吡非尼酮抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌纤维母细胞分化，降低α-SMA阳性应力纤维构建；抑制paxillin、tensin蛋白表达，抑制粘着斑分化成熟，相应粘着斑面积和数量较空白对照组减小（P﹤0.05）。⑵Western Blot结果显示，吡非尼酮单独作用或联合TGF-β1均可抑制Akt与磷酸化Akt，FAK与磷酸化FAK表达（P﹤0.05）；吡非尼酮对Akt磷酸化抑制作用更明显（P﹤0.05）。⑶细胞粘附实验表明，吡非尼酮作用24h后极少细胞粘附生长，明显抑制成纤维细胞对细胞外基质的粘附作用（P﹤0.05）。
　　结论：通过下调 TGF-β1介导的Akt/FAK信号通路活化，吡非尼酮明显抑制α-SMA应力纤维构建和粘着斑分化成熟，降低细胞与细胞外基质粘附，阻碍成纤维细胞发挥促纤维化作用，因此可用于对抗甲状腺相关眼病纤维化发展和改善临床症状。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、眼外肌来源成纤维细胞的原代培养、鉴定及诱导分化

1.1 对象和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

二、吡非尼酮抑制成纤维细胞增殖、分化、迁移及收缩功能的实验研究

2.1 对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4 小结

三、吡非尼酮抑制眼眶成纤维细胞应力纤维重构及粘着斑成熟作用的实验研究

3.1 对象和方法

3.2结果

3.3 讨论

3.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:甲状腺相关眼病发病机制与成纤维细胞的相关作用

致谢