细胞因子IGFBP5在脐带间充质干细胞介导牙周组织再生中的作用及机制研究

摘要

目的：
　　目前间充质干细胞已成为牙周组织再生的种子细胞，然而其定向分化的分子调控机制仍未完全明确，限制了其研究及应用。IGFBP5作为胰岛素样生长因子轴的重要组成，在骨组织发育和再生中有着重要作用，然而其在间充质干细胞及牙周组织再生中的作用尚不清楚。本研究探讨IGFBP5在间充质干细胞成骨分化及牙周组织再生中的作用，进而可作为潜在的细胞因子应用于组织工程化的牙周组织再生。
　　方法：
　　1.间充质干细胞的获取
　　2.构建病毒质粒
　　通过NCBI数据库查询IGFBP5的基因序列，设计IGFBP5基因全长的PCR引物，用PCR的方法得到IGFBP5的全长并加表面标记Flag Tag，将其连接到慢病毒的表达载体上，测序鉴定，最终构建成Flag-IGFBP5的质粒。
　　3.病毒包装及收集
　　慢病毒对照空白质粒、Flag-IGFBP5的质粒及相应的包装质粒（△-F8-74和pMDG）在293T细胞进行转染，48小时后，收集上清，进行病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱。
　　4.稳定转染细胞系的建立
　　对照质粒及Flag-IGFBP5的病毒转染脐带干细胞，转染后一周用流式细胞仪通过筛选标记物GFP得到稳定转染细胞，在mRNA和蛋白水平检测外源性IGFBP5的表达，得到IGFBP5过表达的稳定转染脐带干细胞。
　　5. IGFBP5对干细胞成骨分化性能影响的体外研究
　　用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨方向分化诱导。通过测定碱性磷酸酶活性来检测早期成骨分化指标碱性磷酸酶，通过ARS染色及测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力。并在诱导后3天、7天、10天、2周、3周的不同时间点收获细胞，提取mRNA，在RNA水平检测各个时期成骨分化指标，来研究IGFBP5对间充质干细胞成骨分化的作用。
　　6.脐带间充质干细胞再生小型猪牙周组织的体内研究
　　建立小型猪牙周炎动物模型：采用制造骨缺损、结扎丝线及局部涂布牙周致病菌P.g的方法建立小型猪实验性牙周炎模型，在下颌第一恒磨牙近中邻面形成3 mm×5 mm×7 mm缺损，然后在缺损处放置丝线，局部涂布牙周致病菌P.g。手术后6周可成功形成牙周炎骨缺损模型。
　　7只五指山小型猪建立牙周炎模型，共14侧，随机分为3组：第1组（未治疗对照组）：在建模后做翻瓣刮治；第2组（Vector组）：在建模后做翻瓣刮治+Vector转染的脐带干细胞；第3组（Flag-IGFBP5组）：在建模后做翻瓣刮治+过表达IGFBP5脐带干细胞。治疗后1个月、3个月通过CT影像学、Geomagic Studio12骨计量分析、牙周临床指标检查、ELISA和组织病理学结果，观察IGFBP5对脐带干细胞介导的小型猪牙周炎缺损组织再生修复能力的影响。
　　7.统计学分析
　　用统计软件SPSS11.5，采用t检验或者方差分析，P值小于0.05表示有统计学意义。
　　结果：
　　1.构建病毒质粒、病毒包装及收集转染脐带干细胞，通过real-time RT-PCR和Western Blot方法鉴定IGFBP5过表达效果，结果显示IGFBP5过表达效果达80％。
　　2.通过测定4d碱性磷酸酶活性、3wARS染色、钙离子浓度和诱导后1w、2w、3w不同时间点收取的mRNA检测，结果显示与对照组相比，过表达IGFBP5的脐带间充质干细胞ALP活性、ARS染色、钙离子浓度显著增多，成骨/成牙本质的分化指标OSX、ON、COL1A2、OPN、DSPP、DMP1的表达升高。
　　3.通过Geomagic Studio12三维计算新生骨量、CT影像、牙周临床指标检查、ELISA及组织病理学结果表明：干细胞治疗12w后，与未治疗对照组和Vector组相比，Flag-IGFBP5组牙龈缘无红肿，位置正常；临床检查指标PD和AL恢复正常；有大量牙槽骨和新生牙骨质生成，新形成的牙周膜纤维附着在牙骨质与牙槽骨之间，牙周组织再生良好；龈沟液中炎性因子IL8、IFNr、TNFa、IL1b的表达量显著低。
　　结论：
　　1. IGFBP5可以促进脐带间充质干细胞成骨分化功能。
　　2. IGFBP5可以促进脐带间充质干细胞介导的牙周组织再生功能，抑制牙周局部炎症反应。
　　3. IGFBP5可作为候选细胞因子用于组织工程化的牙周组织再生治疗。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、IGFBP5对脐带间充质干细胞体外成骨分化功能影响的研究

1.1对象和方法

1.1.1实验材料

1.1.2主要试剂

1.1.3主要设备

1.1.4间充质干细胞的获取、分离和培养

1.1.5间充质干细胞的冻存和复苏

1.1.6构建病毒质粒

1.1.7细胞培养基上清中IGFBP5的含量

1.1.8体外成骨诱导分化

1.1.9统计学分析

1.2结果

1.2.1在mRNA和蛋白水平，IGFBP5在PDLSCs和BMSCs、WJCMSCs、ADSCs中的表达差异

1.2.2通过real-time RT-PCR 和Western Blot鉴定，IGFBP5过表达效果达80%

1.2.3 IGFBP5过表达后导致WJCMSCs骨向分化潜能显著增强，矿化能力增强

1.2.4 IGFBP5过表达后促进骨粘连蛋白（ON）、Ⅰ型胶原a2链（COL1A2）、骨桥蛋白（OPN）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、牙本质基质酸性磷酸化蛋白1（DMP1）、OSX蛋白（OSX）表达上调

1.3讨论

1.4小结

二、IGFBP5对脐带间充质干细胞介导的牙周组织再生影响的研究

2.1对象和方法

2.1.1主要实验动物

2.1.2干细胞制剂的制备

2.1.3建立小型猪实验性牙周炎骨缺损模型

2.1.4间充质干细胞再生修复小型猪实验性牙周炎骨缺损

2.1.5治疗后观察指标

2.1.6标本固定，脱钙，脱水包埋，制作石蜡切片

2.1.7石蜡切片HE染色步骤

2.1.8统计学分析

2.2结果

2.2.1小型猪牙周炎骨缺损模型的建立

2.2.2 IGFBP5促进牙周临床检查指标PD、AL的改善

2.2.3 IGFBP5显著增强脐带间充质干细胞介导的牙周骨组织再生

2.2.4 IGFBP5显著增强脐带间充质干细胞介导的牙周组织再生

2.2.5 IGFBP5显著抑制炎性因子IL8、IFNr、TNFa、IL1b的表达

2.3讨论

2.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 胰岛素样生长因子结合蛋白与骨组织发育及再生研究进展

致谢