SAA通过诱导中性粒细胞形成NETs参与RA炎症机制的研究

摘要

目的：
　　中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs），是由中性粒细胞在适当的刺激下形成的由染色质及粘附其上的颗粒蛋白构成的网状结构。NETs形成后能够发挥免疫防御的功能，此外，它参与了多种病理过程。在多种自身免疫病的患者体内发现NETs形成异常，并且在多个方面影响了病程进展。血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A,SAA），作为急性时相蛋白的一种，是炎症反应的重要参与者。本研究组之前研究发现在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）患者的血清和滑膜组织中SAA表达量升高，并与RA的疾病活动程度呈正相关关系。SAA可作用于中性粒细胞能够引起多种效应，但其是否与 NETs的形成有关尚未有研究报道。SAA作用于中性粒细胞能够诱导中性粒细胞生成活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）。而ROS的形成是NETs形成过程中的关键步骤，且有报道ROS能够直接诱导中性粒细胞形成NETs，推测SAA可诱导NETs形成。目前有关NETs在RA中的研究刚起步，相关文献只有零星报道，并存在矛盾之处。本研究的主要目的是探究RA患者体内NETs的形成，及其是否受SAA的诱导以及NETs在RA炎症反应中的作用。
　　方法：
　　1. ELISA的方法检测血清中的MPO、NE含量，荧光染色方法相对定量地检测RA患者与健康对照血清中的细胞外DNA含量。
　　2.免疫荧光法检测并观察RA和OA患者滑膜组织中的NETs。
　　3. Pearson线性相关分析RA血清中NETs（MPO）含量与RA疾病活动度（相关指标：ESR、CRP和DAS28）的相关性。
　　4. Pearson线性相关分析RA血清中NETs（MPO）含量与血清中相应抗体含量（anti-CCP、RFIgG、RFIgA）的相关性。
　　5. MTT实验分析NETs对体外培养的RAFLS和HUVECs增殖的影响。
　　6.密度梯度离心法分离健康志愿者外周血中的中性粒细胞，分离后台盼蓝染色鉴定细胞活力，HE染色分析细胞纯度。
　　7.将分离获得的中性粒细胞体外培养，并分为SAA组、LPS组和阴性对照组，分别加入SAA、LPS和tris-HCL缓冲液作为刺激剂，诱导NETs的形成。荧光染色法观察上述培养细胞形成NETs细胞的百分率。
　　8. ELISA的方法定量检测上述培养细胞上清中的h3含量。
　　结果：
　　1.RA组的MPO水平（4.257±0.4840mg/L），NE水平（1.992±0.07389mg/L），均显著高于健康对照组：MPO（1.054±0.1130mg/L），NE（1.707±0.06374 mg/L）(P<0.05)。RA组的DNA含量（17.51±1.319RFU）显著低于健康对照组（22.68±0.9035RFU）(P<0.05)。
　　2.免疫荧光结果显示，相对于OA患者，RA滑膜组织中观察到更多的NETs。
　　3. pearson线性相关分析结果显示，RA患者血清中的MPO水平与ESR（R2=0.365, P<0.05）和DAS28（R2=0.288,P<0.05）呈正相关，而与血清中的CRP(R2=0.0256,P>0.05)含量无相关关系。
　　4. Pearson线性相关分析结果显示，RA患者血清中的MPO水平与血清中抗体含量（anti-CCP、RFIgG、RFIgA）无相关关系。
　　5. NETs能够促进体外培养的FLS与HUVECs的增殖。
　　6. HE染色鉴定分离的细胞中，中性粒细胞纯度在95％以上，台盼蓝染色鉴定分离的中性粒细胞活力在95%以上。
　　7.形成NETs的细胞占总细胞的百分率，SAA组显著高于阴性对照（Tris-HCL缓冲液，NC组）组（SAA：0.168±0.008；NC：0.039±0.006；F=46.08， P<0.05, n=12）。
　　8.细胞培养液上清中h3的含量SAA组也显著高于阴性对照组（SAA:34.24±0.57；NC：24.03±0.74；F=56.25，P<0.05，n=12）。
　　结论：
　　1. RA患者血清中的MPO含量和NE含量显著高于健康对照组，提示RA患者血清中可能有 NETs形成的增高。免疫荧光结果显示 RA滑膜组织中 NETs的形成显著高于OA，说明RA滑膜组织中NETs形成增多。以上结果提示至少在RA滑膜组织局部NETs形成增多。
　　2. MPO含量与DAS28、ESR呈正相关关系，提示MPO与RA炎症反应有关。RA患者滑膜中 NETs形成增多，且 NETs能够促进体外培养的 FLS和HUVECs增殖，提示中性粒细胞或通过形成NETs直接促进RA的滑膜增生和血管翳形成，参与RA滑膜炎症。
　　3. SAA组与LPS组形成NETs的细胞百分率和细胞培养液上清中的h3水平显著高于阴性对照组，提示SAA能够在体外诱导中性粒细胞形成NETs。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、NETs参与RA炎症反应的研究

1.1对象和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4小结

二、血清淀粉样蛋白A诱导中性粒细胞形成NETs

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:中性粒细胞胞外诱捕网与自身免疫病

致谢

个人简历