骨髓间充质干细胞移植修复慢性期脊髓损伤的基础研究和转化探索

摘要

目的：
　　建立与临床相似的创伤性慢性期脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）大鼠模型，通过核磁共振弥散张量技术（Diffusion Tensor Imaging, DTI）和弥散纤维束示踪成像技术（Diffusion Tensor Tracking, DTT）对动物模型和治疗方法进行评估，创立核磁共振介导的大鼠创伤性脊髓空洞内定位移植的方法，进而探索骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs）移植修复慢性期脊髓损伤的疗效、最佳剂量及其作用机制。
　　方法：
　　1.动物模型制作以PSI-IH Impactor制作大鼠脊髓T10挫裂伤模型，连续6w每周对实验动物行BBB评分、核磁共振常规扫描、弥散张量成像和弥散纤维束示踪成像检测。
　　2.脊髓空洞内定位移植以慢性期SCI大鼠为对象，以Fe3O4磁性纳米粒子为移植物，通过大鼠的体表定位，在MRI介导下分别行2次独立的8μl磁性纳米粒子脊髓空洞内定位移植。
　　3. BMSCs分离培养采用全骨髓分离法分离培养BMSCs，应用流式细胞仪和光镜下观察对细胞进行鉴定。
　　4. BMSCs移植修复慢性期 SCI以脊髓空洞内定位移植的方法，分别将DMEM、4×105、8×105和1×106的BMSCs移植到慢性期SCI动物模型的损伤区域。移植后连续观察8周，分别采用BBB评分和旋转测试评估SCI大鼠功能恢复情况，采用样品的肉眼观察、MRI常规T2扫描、DTT和DTI分析、免疫荧光、HE染色的方法分析大鼠局部损伤区域变化，通过对脊髓组织切片的MAP2、Nestin、Tublin、GFAP、VEGF和 BDNF的免疫荧光染色，探讨分析不同浓度BMSCs对慢性期脊髓损伤后神经细胞修复、胶质瘢痕清除、血管重塑及营养因子旁分泌的作用。
　　结果：
　　1.成功建立大鼠慢性期SCI动物模型，本实验中动物无死亡及感染迹象， SCI后1w、2w、3w、4w、5w、6w的大鼠BBB评分为4.21±0.35、5.08±0.72、5.79±0.88、6.12±0.69、6.39±0.55、6.44±0.62，MRI常规扫描可见损伤区域胶质瘢痕清晰和髓内高信号液腔空洞，该空洞可分为3类即：中央型、分裂型、弥散型。
　　SCI后局部损伤区域和液腔空洞于SCI后1w、2w、3w、4w、5w、6w的体积分别为0 mm3、（0.21±0.35） mm3、（2.21±0.44） mm3、（3.18±0.82） mm3、（3.27±0.79）mm3和（3.31±0.73）mm3。DTI分析提示，SCI后1w、2w、3w、4w、5w、6w损伤区域的 ADC值分别为（2351.91±780.73）×10-6mm2/s、（2033.22±720.11）×10-6mm2/s、（1972.10±710.31）×10-6mm2/s、（1604.22±720.51）×10-6mm2/s、（1550.62±656.11）×10-6mm2/s和（1549.71±660.73）×10-6mm2/s，FA值分别为0.30±0.06、0.31±0.07、0.32±0.07、0.33±0.09、0.34±0.08和0.34±0.08。
　　2. MRI介导下完成损伤空洞内定位移植，SCI空洞体积由（5.71±0.21）mm3降低至（3.23±0.36）mm3，经过二次重复操作验证后，脊髓空洞的体积由（3.23±0.36）mm3降低至（1.48±0.72）mm3，移植操作成功，并且该方法具有可重复性。
　　3.经流式细胞仪筛查分析，BMSCs的免疫表型为：CD105、CD90和CD44阳性，CD45和CD34阴性，符合间充质干细胞的表型特征，并且提示细胞样品中不存在造血系统的细胞污染。
　　4.顺利完成细胞定位移植，移植后即刻进行MRI扫描可见移植物位于损伤中心。实验动物无死亡、感染或致瘤迹象。大鼠功能恢复评估结果提示，相较DMEM组，细胞移植组均有不同程度的改善（p<0.05），1×106细胞组改善最为明显。通过肉眼观察、MRI常规扫描、DTT和DTI分析、免疫荧光和HE染色分析对大鼠局部损伤区域的变化分析，结果提示，相较DMEM组，细胞移植组均有不同程度的改善（p<0.05），1×106细胞组改善最为明显。脊髓组织切片的MAP2、Nestin、GFAP、Tublin、VEGF和BDNF的免疫荧光染色结果提示不同浓度BMSCs对慢性期SCI后神经细胞的修复、胶质瘢痕清除、血管重塑及营养因子旁分泌作用疗效不同，其中1×106细胞组改善最为明显。
　　结论：
　　大鼠慢性期脊髓损伤模型于伤后4w成熟，弥散张量成像技术和弥散纤维束示踪成像是诊断和评估损伤程度及治疗手段的高效量化方法，损伤局部骨髓间充质干细胞移植修复大鼠慢性期脊髓损伤是一种行之有效的修复手段。骨髓间充质干细胞可通过其在神经细胞修复、胶质瘢痕清除、血管重塑及营养因子旁分泌的作用机制对慢性期脊髓损伤进行多层面的修复，本研究结果提示骨髓间充质干细胞修复大鼠慢性期脊髓损伤最佳适用剂量为5×106细胞/kg，为骨髓间充质干细胞移植的临床转化提供了一定的依据。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、大鼠的慢性期脊髓损伤模型建立与统一性评估

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、MRI介导下SCI后大鼠磁性纳米粒子脊髓空洞内定位移植

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、骨髓间充质干细胞的体外分离、培养与鉴定

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

四、骨髓间充质干细胞移植修复慢性期SCI的实验研究

4.1对象和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述: 间充质干细胞移植修复脊髓损伤：从基础研究到临床转化

致谢