中性粒细胞蛋白酶3在阵发性睡眠性血红蛋白尿症血栓形成中的作用研究

摘要

目的：
　　阵发性睡眠性血红蛋白尿症(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一种获得性造血干细胞基因突变的克隆性疾病，其病理机制为PIG-A基因突变致膜锚链蛋白缺失而引发功能性蛋白缺乏。临床表现为血管内溶血、骨髓衰竭及易形成血栓，血栓形成是危害性最大最常见的致死原因。血栓形成机制尚不明确，目前认为可能与补体介导的溶血、一氧化氮（NO）的消耗、内皮损伤、纤溶系统失调、血小板激活等因素有关，它们均直接或间接源于溶血。近年研究发现―间接‖膜锚链蛋白酶3（proteinase3，PR3）是一种重要的抗凝调节因子，在PNH患者中表达明显异常。本研究从基因水平和功能蛋白表达水平检测PNH患者PR3，探究其在PNH患者血栓形成中的作用。
　　方法：
　　本研究以27例PNH患者为研究对象，25名为同期正常对照组，采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测中性粒细胞膜表面锚链蛋白NB1和PR3的表达；采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测PNH患者及同期正常对照组血浆中NB1、PR3和凝血酶受体1（PAR-1）的浓度；采用实时定量聚合酶链式反应技术（real-time PCR，RT-PCR）检测PNH患者及同期正常对照组PR3和NB1上游mRNA的表达，采用免疫印迹技术（Western blot,WB）检测PNH患者及同期正常对照组中性粒细胞中总蛋白PR3的表达。整理并记录患者和同期对照组D-二聚体检测指标，并将其与PR3、PAR-1做相关性分析。
　　结果：
　　1.PNH患者中性粒细胞膜上PR3、NB1水平降低
　　PNH患者PNH细胞（CD59-PR3+/CD59-）膜上PR3的水平[（70.40±29.86）％]低于同期对照组正常细胞（CD59+PR3+/CD59+）膜上的水平[（93.28±10.53）%]（P=0.01）；PNH患者CD59+细胞（CD59+PR3+/CD59+）膜上PR3的水平[（85.68±22.21）%]与同期对照组正常细胞（CD59+PR3+/CD59+）膜上的水平[（93.28±10.53）%]无显著性差异（P=0.131）；PNH患者PNH细胞（CD59-PR3+/CD59-）膜上PR3的水平[（70.40±29.86）%]低于CD59+细胞（CD59+PR3+/CD59+）膜上的水平[（85.68±22.21）%]（P=0.046）。PNH患者PNH细胞（CD59-NB1+/CD59-）膜上NB1的水平[（20.61±26.07）%]低于同期对照组正常细胞（CD59+NB1+/CD59+）膜上的水平[（67.72±19.65）%]（P=0.001）；PNH患者CD59+细胞（CD59+NB1+/CD59+）膜上NB1的水平[（72.25±25.62）%]与同期对照组正常细胞（CD59+NB1+/CD59+）膜上的水平[（67.72±19.65）%]无显著性差异（P=0.46）；PNH患者在PNH细胞（CD59-NB1+/CD59-）膜上NB1的水平[（20.61±26.07）%]低于在CD59+细胞（CD59+NB1+/CD59+）膜上的水平[（72.25±25.62）%]（P=0.001）。
　　2.PNH患者血浆中PR3的浓度（2262.72±802.80）pg/ml低于同期对照组（3292.92±651.68）pg/ml（P=0.001），血浆中NB1的浓度较正常对照组无明显改变（P=0.32）。
　　3.PNH患者PR3、NB1的mRNA的水平均较同期对照组无显著差异（P=0.629， P=0.836）。
　　4.PNH患者中性粒细胞总蛋白PR3的水平较同期对照组无显著差异。
　　5.PNH患者血浆中PAR-1浓度水平（1.38±0.96）ng/ml高于同期对照组（0.47±0.29）ng/ml（P=0.001）。
　　6．5例 PNH伴血栓患者D-Dimer水平高于22例PNH不伴有血栓的患者（P=0.049）。
　　7. PNH患者D-dmier与中性粒细胞膜PR3水平呈负相关（r=-0.503 P=0.028）, D-dmier与PAR-1水平正相关（r=0.65 P=0.002），PR3与PAR-1水平呈负相关（r=-0.456 P=0.043）。
　　结论：
　　（1） PNH患者间接膜锚链蛋白PR3明显减低；
　　（2） PNH患者血浆低水平PR3，高水平PAR-1与血栓关系密切。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1.1 对象和方法

1.1.1病例和对照

1.1.2主要试剂与仪器

1.1.3实验方法

1.1.4 统计学方法

1.2结果

1.2.1 PNH患者的临床资料

1.2.2外周血分离纯化中性粒细胞纯度可达80%以上

1.2.3 PNH中性粒细胞分选PNH（CD59-）细胞，纯度可达70%以上

1.2.4 PNH患者外周血中性粒细胞膜上mPR3、NB1的水平均降低

1.2.5高PNH克隆患者中性粒细胞上mPR3和NB1的表达与低PNH克隆患者中性粒细胞上mPR3和NB1的表达均无显著性差异。

1.2.6 PNH患者血浆中PR3浓度比正常对照组水平降低，血浆中NB1浓度较正常对照组无显著性差异

1.2.7 PNH患者PR3、NB1的mRNA较正常对照组无显著性差异。

1.2.8 PNH患者胞浆中PR3的表达水平较正常对照组无明显改变。

1.2.9 PNH患者血浆中PAR-1浓度较正常对照组水平增高

1.2.10 PNH患者D-Dimer水平高于正常对照，5例PNH伴血栓患者D-Dimer水平高于22例PNH不伴有血栓的患者。

1.2.11 PNH患者D-dmier与中性粒细胞膜PR3水平呈负相关, D-dmier与PAR-1水平正相关，PR3与PAR-1水平呈负相关。

1.3 讨论

1.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述: 血小板在PNH血栓形成中的作用

致谢

个人简历