产生大量IL-17的γδT细胞在沙眼衣原体感染中对Treg细胞的调节

摘要

研究目的：
　　γδT细胞是参与宿主固有免疫应答的主要效应细胞，是桥联固有免疫和适应性免疫的桥梁。有研究报道，IL-17+γδT能够抑制调节性 T细胞的增殖及功能。本研究利用TCRδ-/-小鼠探讨沙眼衣原体小鼠肺炎症中产生IL-17的γδT细胞对Treg细胞增殖的影响以及可能的作用机制，为γδT细胞与Treg细胞相互作用提供理论依据，也为固有免疫和适应性免疫的相互调节增添新的内容。
　　研究方法：
　　取6-8周龄雌性WT(C57BL/6)和TCRδ-/-（C57BL/6遗传背景）小鼠，经鼻吸入1×103IFU沙眼衣原体小鼠肺炎菌株（Chlymydia muridarum，Cm），诱导小鼠沙眼衣原体肺炎。在感染的不同时间点处死小鼠，收集肺泡灌洗液，制备肺组织单个核细胞悬液，用荧光素标记的抗鼠CD3、γδT抗体染色，流式细胞仪检测γδT的增殖；利用细胞内细胞因子染色技术检测肺组织CD3+γδT细胞及Vγ1和Vγ4γδT细胞亚群分泌IL-17水平；用ELISA方法检测WT和TCRδ-/-小鼠肺泡灌洗液中IL-17含量，探讨Cm呼吸道感染诱导的γδT细胞增殖及IL-17的产生。利用流式细胞术检测 WT和 TCRδ-/-小鼠脾脏及肺组织 CD4+CD25+T及CD25+Foxp3+T细胞水平，确定沙眼衣原体呼吸道感染诱导的Treg细胞的增殖；进一步利用RT-PCR技术探讨WT和 TCRδ-/-小鼠肺组织Treg细胞相应转录因子Foxp3 mRNA表达以及与Treg细胞活化及功能相关的细胞因子IL-2、TGF-β和IL-10 mRNA表达水平改变，从而探讨γδT细胞对Treg细胞增殖的影响以及可能的作用机制。
　　实验结果：
　　经鼻腔吸入一定剂量的Cm诱导小鼠沙眼衣原体肺炎及CD3+γδT+细胞在小鼠肺组织的增殖及产生大量IL-17。感染第1天CD3+γδT+细胞百分率即开始增高（*P<0.05），于感染第7天达到高峰（***P<0.001），随后降低，到感染第10天基本下降到未感染水平；细胞内细胞因子染色结果显示Cm感染诱导γδT细胞在感染第一天既分泌大量的 IL-17（**P<0.01），至感染第三天达到高峰（***P<0.001），至感染后第五天γδT细胞产生 IL-17的水平已显著降低（*P<0.05）。进一步我们对小鼠肺组织存在的两个重要的γδT细胞亚群 Vγ1和Vγ4 IL-17的分泌进行了研究，结果显示 Cm感染小鼠肺组织 Vγ1基本不分泌IL-17，而Vγ4则分泌大量的IL-17，尤其是在感染第3天（***P<0.001）达到分泌高峰，随后迅速降低，至感染第10天降低至基础水平，其变化趋势与γδT细胞分泌IL-17一致。另外，我们的结果还证实，γδT细胞是感染早期IL-17的主要来源，TCRδ-/-小鼠肺泡灌洗液BAL中IL-17水平显著低于WT小鼠（*P<0.05）。Cm感染能够诱导小鼠外周免疫器官及局部炎症部位Treg细胞增殖。与WT小鼠比较，TCRδ-/-小鼠脾组织Treg细胞百分率在感染后第3天显著升高（**p<0.01），而感染第7天则显著降低（**p<0.01）；进一步肺组织中Treg相关转录因子Foxp3 mRNA表达趋势与脾脏Treg细胞的变化一致（*P<0.05），提示在Cm感染的不同时间点，γδT细胞通过不同的途径调节 Treg细胞的增殖。进一步对其可能的调节机制进行研究，结果发现，感染后第3天WT和TCRδ-/-小鼠肺组织Treg细胞活化因子IL-2 mRNA仅微量表达，而感染后第7天IL-2 mRNA在两组小鼠肺组织明显表达，且TCRδ-/-小鼠明显低于WT小鼠（**P<0.01）。肺组织Treg细胞功能性细胞因子TGF-β和IL-10的PCR结果显示，感染第3天TCRδ-/-小鼠IL-10水平明显高于WT小鼠（*P<0.05），而感染第7天IL-10分泌明显降低（*P<0.05），与Treg细胞增殖变化一致，而肺组织TGF-β mRNA表达在两组小鼠未见明显差异。
　　结论：
　　Cm呼吸道感染诱导小鼠肺组织γδT细胞增殖并在感染早期分泌大量的IL-17，γδT细胞是感染早期IL-17的主要来源，其中Vγ4是分泌IL-17的主要γδT细胞亚群。Cm感染能够诱导小鼠外周免疫器官及局部炎症部位Treg细胞增殖，在Cm呼吸道感染中存在着γδT细胞对Treg细胞的免疫调节，但在感染的不同阶段调节机制不同，感染早期，γδT细胞可能通过分泌大量的 IL-17抑制 Treg细胞增殖，至感染中期IL-2的大量产生，可能是通过IL-2/IL-2R途径促进Treg细胞；在沙眼衣原体感染中，γδT细胞主要通过影响 Treg细胞功能性细胞因子IL-10的表达介导Treg细胞的免疫抑制功能。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

材料和方法

1.实验材料

1.1 主要仪器和设备

1.2主要试剂

1.3主要试剂的配制

1.4 实验菌种

1.5 实验动物

2实验方法

2.1 沙眼衣原体繁殖及鉴定

2.2感染动物

2.3 肺组织衣原体繁殖情况测定

2.4 小鼠脾组织单细胞悬液制备

2.5 小鼠肺组织单细胞悬液制备

2.6肺泡灌洗液制备

2.7流式细胞染色

2.8 RT-PCR

2.9 ELISA检测细胞因子

2.10 统计分析

结果

1.Cm感染诱导γδT细胞增殖及产生大量的IL-17

1.1Cm呼吸道感染诱导γδ T细胞在小鼠肺组织增殖

1.2Cm呼吸道感染诱导γδ T细胞在感染早期分泌大量IL-17

1.3 Vγ4为Cm感染后主要分泌IL-17的γδT细胞亚群

1.4小结

2.Cm呼吸道感染诱导Treg细胞增殖

2.1 Treg细胞在小鼠脾组织的增殖

2.2 Treg细胞在感染组织的增殖

2.3小结

3．Cm呼吸道感染中存在γδ T细胞对Treg细胞的调节

3.1γδ T细胞对小鼠脾组织Treg细胞增殖的影响

3.2γδT细胞对小鼠肺组织Foxp3 mRNA表达的影响

3.3 γδT细胞能够促进感染中期IL-2 介导的Treg细胞分化

3.4 γδT细胞主要影响Treg细胞IL-10的产生

3.5 小结

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:Th17细胞和γδT细胞在肺部疾病中的相互调节

致谢

个人简历