功能性磁性纳米粒子在颞叶癫痫模型中的靶向诊治价值

摘要

研究目的：
　　癫痫是神经内科最常见的疾病之一，大部分癫痫患者经规范化抗癫痫药物治疗后可控制，但仍有约20%-30%难以缓解，成为难治性癫痫，其中最常见的难治性癫痫类型是颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）。目前癫痫的治疗包括药物和手术两种治疗手段。药物治疗的关键是抗癫痫药物更好地达到致痫灶组织而手术治疗的关键在于癫痫病灶的精确定位。颅脑MRI因图像清晰度高、无电离辐射、对人体无放射性损害等优点成为癫痫病灶最常见的影像学定位方法。近年来磁性纳米粒子因其独特的优势在各个领域应用广泛，其中超顺磁性氧化铁纳米粒子易透过各种生理屏障到达指定部位。Cy5作为近红外区的染料分子具有超灵敏成像的优点，可作为荧光探针分子用于光学成像。α-甲基色氨酸（alpha-methyl-L-tryptophan，AMT）由外界合成，在致痫灶组织中高摄取、高聚集。本研究将Cy5和AMT螯合至超顺磁性氧化铁纳米粒子上构建核磁/光学双模成像系统，从影像学及光学上证明AMT能对颞叶癫痫模型病灶的主动靶向定位作用。然而AMT进入癫痫病灶后并不能对癫痫病灶进行靶向治疗，目前研究表明炎症反应与癫痫发作密切相关，其中IL-1β是参与癫痫发作最常见的炎性因子。使用IL-1β单克隆抗体中和IL-1β可以减轻癫痫发作，然而血脑屏障的存在阻碍了IL-1β单克隆抗体进入癫痫灶组织中。我们将IL-1β螯合至超顺磁性氧化铁纳米粒子上，借助超顺磁性氧化铁纳米粒子易透过血脑屏障的优势，观察螯合IL-1β单克隆抗体的超顺磁性氧化铁纳米粒子对癫痫病灶的靶向诊断和治疗价值。
　　研究方法：
　　本研究分为两部分进行实验，首先采用氯化锂-匹罗卡品制作颞叶癫痫模型。分为三组，第一部分：将Cy5及AMT螯合至超顺磁性氧化铁纳米粒子形成主动靶向纳米探针(Cy5-AMT-SPIONs)作为实验组，将Cy5螯合至超顺磁性氧化铁纳米粒子（Cy5-SPIONs）和单纯的超顺磁性氧化铁纳米粒子（plain-SPIONs）作为对照组进行实验研究。于癫痫大发作后48h尾静脉注射磁性纳米粒子，粒子注射前和注射后4h分别进行颅脑MRI扫描并测量比较各组T2值，行普鲁士蓝染色观察铁粒子在致痫灶组织中的分布情况，行尼氏染色观察海马神经元损伤情况，行免疫荧光染色观察Cy5在致痫灶组织中的分布情况和星形胶质细胞增生情况。第二部分，将IL-1β单克隆抗体螯合至超顺磁性氧化铁纳米粒子形成主动靶向纳米粒子探针(anti-IL-1βmAb-SPIONs)作为实验组，将plain-SPIONs和生理盐水(NS)作为对照组，于癫痫大发作后3d、14d经尾静脉注射粒子，粒子注射前和注射后4h进行颅脑MRI扫描并进行T2值的测量和比较。行普鲁士蓝染色、尼氏染色、免疫荧光染色病理组织学研究并应用Western blot、RT-PCR检测IL-1β、NF-κB的表达情况。
　　研究结果：
　　1.大部分SD大鼠腹腔注射匹罗卡品最终出现全身强直-阵挛样的癫痫大发作。第一部分实验模型成功率为80%(总共40只大鼠，其中35只建立成功的急性期颞叶癫痫模型，后死亡3只，总共存活32只)；第二部分实验模型成功率：76.7%(60只大鼠，49只成功建立颞叶癫痫模型，后死亡3只，存活46只)。
　　2.颅脑MRI扫描可见双侧颞叶致痫灶组织呈高信号，第一部分：注射Cy5-AMT-SPIONs后T2信号明显降低，T2值显著下降，有明显差异(P＜0.05)。第二部分：注射anti-IL-1βmAb-SPIONs后T2信号明显降低，T2值显著下降，有明显差异(P＜0.05)。
　　3.普鲁士蓝染色发现铁粒子主要分布在细胞浆中呈蓝色，第一部分：注射Cy5-AMT-SPIONs后铁粒子分布最密集，与注射plain-SPIONs、Cy5-SPIONs相比较有明显差异(P＜0．05)。第二部分：注射NS后未见铁粒子，注射plain-SPIONs、anti-IL-1βmAb-SPIONs可见蓝棕色颗粒，注射anti-IL-1βmAb-SPIONs后铁粒子分布最密集，与注射NS和plain-SPIONs相比较有明显差异(P＜0．05)。
　　4.尼氏染色观察各组大鼠海马CA1、CA3区可见神经元形态异常、缺失，细胞排列紊乱，空泡样变性。第一部分，各组间比较无明显差异。第二部分：注射anti-IL-1βmAb-SPIONs相对注射NS、plain-SPIONs神经元形态异常、缺失，细胞排列紊乱，空泡样变性等情况明显改善。
　　5.免疫荧光结果显示，第一部分：注射plain-SPIONs后无Cy5分布，注射Cy5-SPIONs、Cy5-AMT-SPIONs均可见Cy5的分布，各组间相比较，Cy5分布有明显差异(P＜0.05)。各组星形胶质细胞均有明显增生，各组间相比较无明显差异。第二部分：各组均可见星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化，其中注射anti-IL-1βmAb-SPIONs相对注射NS、plain-SPIONs后星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化情况得到明显改善。
　　6.第二部分Western blot和RT-PCR结果均表明注射anti-IL-1βmAb-SPIONs相对注射plain-SPIONs、NS后IL-1β、NF-κB p65的表达明显下降。
　　研究结论:
　　1.单纯的SPIONs可以透过血脑屏障，但是铁粒子浓度不同可能影响其在颅脑MRI上的成像情况。
　　2.在AMT的主动靶向作用下Cy5、SPIONs更易透过血脑屏障到达致痫灶对癫痫病灶进行定位。
　　3.尼氏染色和免疫荧光染色可见注射 plain-SPIONs、Cy5-SPIONs、Cy5-AMT-SPIONs后神经元缺失、星形胶质细胞增生情况无明显变化，可见功能性的超顺磁性纳米粒子对脑组织无明显毒副作用。
　　4.影像学、组织病理学结合分子生物学结果表明anti-IL-1βmAb-SPIONs可对癫痫病灶进行靶向定位和治疗，为难治性癫痫的诊治提供了新的思路。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、螯合Cy5-AMT-SPIONs双模探针在急性颞叶癫痫模型中的靶向定位

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、螯合anti-IL-1βmAb-SPIONs在颞叶癫痫模型中的靶向诊治价值

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:磁性纳米载药在中枢神经系统中的应用

致谢

个人简历