功能性的磁性纳米粒子用于颞叶癫痫定位的MRI研究

摘要

研究目的：
　　癫痫（epilepsy，EP）是目前第二大常见的慢性脑部疾病，多数患者经抗癫痫药物（anti-eipleptic drugs，ADEs）治疗后可缓解，然而有约20％的癫痫患者在规范使用 ADEs后仍无法良好控制发作，将此类癫痫称为难治性癫痫（intractable epilepsy，IE），其中颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）为成年IE中最常见的类型。新型靶向药物治疗以及外科手术治疗为此类患者带来希望，其中手术已被证实有良好的效果。不管是新型药物的靶向治疗还是行癫痫手术，其成功的关键在于致痫责任病灶的定位，其准确性将影响治疗后的效果和预后，但目前尚无一种检查方法能精确特异地靶向定位其致痫灶（epileptogeniczone，EZ）。关于手术治疗的术前评估，目前多采用核磁共振扫描（Magnatic Resonance Imaging，MRI）、长程视频脑电图监测（vEEG）、正电子发射型计算机断层扫描/计算机断层扫描（PET-CT）及神经电生理等检查进行综合评估致痫灶。其中MRI因其广泛优点成为术前必做的检查，但目前的MRI都缺乏特异性，随着核磁共振分子影像学的深入研究和磁性纳米颗粒（Magnetonanoparticles， MNPs）制备技术的不断完善，我们有望在进行MRI检查基础上，发现一种简便的、无创的方法从而对难治性TLE实现精确定位致痫灶。本实验将在分子水平上，采用一种新型的具有低毒性及超顺磁特性的超顺磁性氧化铁纳米粒子(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)，在其表面螯合一种无放射性的α-甲基色氨酸（alpha–methyl–L–tryptophan，AMT）分子，其能在致痫灶浓集并在MRI有特异表现，探索这一具有功能性的纳米探针能否靶向定位颞叶癫痫模型大鼠致痫灶，并探讨其最佳MRI扫描时间以及其对脑组织的毒副作用。
　　研究方法：
　　本实验采用氯化锂-匹罗卡品建立颞叶癫痫动物模型，实验分为两部分，第一部分：颞叶癫痫模型按照随机原则分为三组，将无放射性的AMT与由氧化铁和葡聚糖组成的SPIONs连接形成靶向纳米探针即AMT-SPIONs实验组，无表面修饰的无靶向SPIONs（plain-SPIONs，P-SPIONs组）和生理盐水（saline组）作为对照材料，于模型大鼠癫痫大发作后72h分别经尾静脉注射，并在注射前后进行磁共振扫描，再将扫描的致痫灶局部组织的信号T2值进行检测和比较，之后断头取脑组织行冰冻切片染色，使用普鲁士蓝染色探讨纳米粒子是否透过血脑屏障，采用FJB染色以及尼氏染色方法观察各组海马神经元的损伤病理情况及初步探讨纳米粒子对脑组织细胞有无毒副作用。第二部分：将AMT-SPIONs组分别于颞叶癫痫模型大鼠急性期（SE后72h）、慢性期（SE后8w）经尾静脉注射，于注射前及注射后60min、120min、240min、480min、24h确定的六个时间点同步行T2序列同参数MR扫描，并测量信号强度T2值。当每个时间点扫描之后行病理组织普鲁士染色鉴定。
　　研究结果：
　　1.氯化锂-匹罗卡品癫痫模型可诱导大鼠表现为典型的颞叶癫痫持续状态，大鼠在清醒状态下，在腹腔注射匹罗卡品约10~30min后，模型大鼠初始表现为口角流涎、双眼充血等外周M受体能反应；继之出现行动刻板、面部抽动、反复点头、平衡力下降等，直至最终出现全身强直-阵挛癫痫大发作。第一部分：造模成功率为90%（50只大鼠，47只成功建立急性期模型，存活45只急性期癫痫模型大鼠）。第二部分：SD大鼠腹腔注射匹罗卡品造模成功率为86%（50只大鼠，43只成功建立急性期模型，存活37只癫痫模型），随机选择12只癫痫大鼠用于急性期实验，剩余的25只癫痫大鼠进行视频监控建立慢性期模型。25只大鼠监控过程中，3只死亡，5只从未表现出自发性癫痫发作，其余17只大鼠为建模成功。每组对死亡的癫痫模型大鼠按随机抽样原则作及时补充。
　　2. MRI T2序列结果显示TLE模型病灶的T2序列高信号，第一部分：给药前三组之间的致痫灶T2值差异无显著性（P>0.05）。saline组癫痫模型大鼠给药前后磁共振扫描T2信号差异无显著性（P>0.05），P-SPIONs组癫痫模型大鼠经尾静脉注射非靶向磁性纳米粒子后，致痫灶局部轻度变暗， T2值差异无显著性（P>0.05），AMT-SPIONs组注射靶向磁性纳米粒子后，致痫灶局部MRI T2加权像明显变暗，T2值下降有统计学意义（P<0.05）。第二部分：注射AMT-SPIONs后，急、慢性期的五个时间点均出现一侧病灶局部T2信号负增强改变，与注射前比较有统计学差异（P<0.05）。急性期各个时间点T2信号下降分别约为注射前的3.79%、6.25%、14.71%、9.96%、6.17%，慢性期各个时间点T2信号下降分别约为注射前的3.86%、8.32%、14.20%、12.79%、8.17%，给药前后T2信号差别有统计学意义（P<0.05），于注射后240min T2值下降最明显。
　　3.急性癫痫模型大鼠脑组织普鲁士蓝染色结果显示，与 saline组比较， AMT-SPIONs组（P<0.01）和P-SPIONs组（P<0.05）脑组织内均有铁颗粒分布，其中AMT-SPIONs组脑组织内蓝棕色铁颗粒明显较P-SPIONs组多（P<0.01）。屏障，采用FJB染色以及尼氏染色方法观察各组海马神经元的损伤病理情况及初步探讨纳米粒子对脑组织细胞有无毒副作用。第二部分：将AMT-SPIONs组分别于颞叶癫痫模型大鼠急性期（SE后72h）、慢性期（SE后8w）经尾静脉注射，于注射前及注射后60min、120min、240min、480min、24h确定的六个时间点同步行T2序列同参数MR扫描，并测量信号强度T2值。当每个时间点扫描之后行病理组织普鲁士染色鉴定。
　　研究结果：
　　1.氯化锂-匹罗卡品癫痫模型可诱导大鼠表现为典型的颞叶癫痫持续状态，大鼠在清醒状态下，在腹腔注射匹罗卡品约10~30min后，模型大鼠初始表现为口角流涎、双眼充血等外周M受体能反应；继之出现行动刻板、面部抽动、反复点头、平衡力下降等，直至最终出现全身强直-阵挛癫痫大发作。第一部分：造模成功率为90%（50只大鼠，47只成功建立急性期模型，存活45只急性期癫痫模型大鼠）。第二部分：SD大鼠腹腔注射匹罗卡品造模成功率为86%（50只大鼠，43只成功建立急性期模型，存活37只癫痫模型），随机选择12只癫痫大鼠用于急性期实验，剩余的25只癫痫大鼠进行视频监控建立慢性期模型。25只大鼠监控过程中，3只死亡，5只从未表现出自发性癫痫发作，其余17只大鼠为建模成功。每组对死亡的癫痫模型大鼠按随机抽样原则作及时补充。
　　2. MRI T2序列结果显示TLE模型病灶的T2序列高信号，第一部分：给药前三组之间的致痫灶T2值差异无显著性（P>0.05）。saline组癫痫模型大鼠给药前后磁共振扫描T2信号差异无显著性（P>0.05），P-SPIONs组癫痫模型大鼠经尾静脉注射非靶向磁性纳米粒子后，致痫灶局部轻度变暗， T2值差异无显著性（P>0.05），AMT-SPIONs组注射靶向磁性纳米粒子后，致痫灶局部MRI T2加权像明显变暗，T2值下降有统计学意义（P<0.05）。第二部分：注射AMT-SPIONs后，急、慢性期的五个时间点均出现一侧病灶局部T2信号负增强改变，与注射前比较有统计学差异（P<0.05）。急性期各个时间点T2信号下降分别约为注射前的3.79%、6.25%、14.71%、9.96%、6.17%，慢性期各个时间点T2信号下降分别约为注射前的3.86%、8.32%、14.20%、12.79%、8.17%，给药前后T2信号差别有统计学意义（P<0.05），于注射后240min T2值下降最明显。
　　3.急性癫痫模型大鼠脑组织普鲁士蓝染色结果显示，与 saline组比较， AMT-SPIONs组（P<0.01）和P-SPIONs组（P<0.05）脑组织内均有铁颗粒分布，其中AMT-SPIONs组脑组织内蓝棕色铁颗粒明显较P-SPIONs组多（P<0.01）。4.尼氏染色结果显示，三组海马CA3区可见大量的异常形态的神经元，表现为体积变小，形态呈不规则改变，染色质固缩，胞核与胞浆分界模糊，尼氏染色阳性细胞计数少；三组比较，其在数量及形态上无明显差异（P>0.05）。
　　5. FJB染色具有选择性标记损伤神经元的特性，其结果显示神经元损伤趋向和尼氏染色结果基本一致，镜下发现，三组海马CA3区都出现大量FJB阳性神经元，与尼氏染色结果中的缺失部位相对应一致，CA1区的FJB阳性神经元相对较少。三组比较FJB阳性神经元数目相差甚微（P>0.05）。
　　研究结论：
　　1. AMT-SPIONs这一功能性的靶向探针在MRI下能透过血脑屏障并靶向定位致痫灶。
　　2.致痫灶显像的MRI最佳扫描时间是注射AMT-SPIONs后的240min。
　　3.发现SPIONs在模型大鼠脑组织内表现为低毒性的特点。
　　4. AMT-SPIONs作为颞叶难治性癫痫的靶向定位载体，为新型靶向抗癫痫药物的研制奠定了基础并引导了新的方向，并暗示了纳米技术在临床疾病的定位、诊断及治疗的重要价值。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、靶向磁性纳米粒子用于急性颞叶癫痫的MRI研究

1对象和方法

1.1实验动物

1.2主要仪器

1.3主要实验试剂

1.4主要溶液及试剂配方

1.5 实验方法

1.6统计学处理

2结果

2.1制作急性癫痫模型情况

2.2颞叶癫痫模型磁共振扫描T2信号值变化

2.3普鲁士蓝染色磁性纳米粒子在急性癫痫模型大鼠脑内的分布

2.4尼氏染色观察急性期癫痫海马神经元缺失

2.5 FJB染色观察急性癫痫大鼠海马神经元损伤

3讨论

3.1癫痫及难治性癫痫的定义

3.2 MRI在难治性癫痫定位的作用

3.3磁性纳米粒子与血脑屏障

3.4 AMT与癫痫的关系

3.5磁性纳米粒子在MRI中的应用

3.6磁性纳米粒子的毒性反应

4小结

二、螯合AMT的SPIONs用于颞叶癫痫MRI的最佳扫描时间的探讨

1实验对象和方法

1.1实验动物

1.2主要仪器 同实验一

1.3主要试剂 同实验一

1.4主要溶液及试剂配方 同实验一

1.5实验方法

1.6统计分析

2结果

2.1造模情况及行为学观察

2.2癫痫模型磁共振扫描

2.3普鲁士蓝染色观察磁性纳米铁颗粒在大鼠脑组织内的分布

3讨论

4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 磁性纳米粒子在生物医学中的应用

致谢

个人简历