在电脉冲刺激调节骨骼肌细胞Akt机制中Axin1的作用研究

摘要

目的：
　　骨骼肌是摄取餐后葡萄糖的主要器官，胰岛素刺激骨骼肌细胞摄取葡萄糖是维持血糖平衡的关键，摄取葡萄糖通过GLUT4转位到细胞膜完成。骨骼肌胰岛素抵抗是指胰岛素刺激骨骼肌摄取葡萄糖的能力减弱，导致持续的餐后高血糖。肌肉收缩能促进骨骼肌摄取葡萄糖，改善胰岛素敏感性。本课题组致力研究肌肉收缩促进骨骼肌葡萄糖摄取的分子机制，我们用过表达 GLUT4HA的小鼠C2C12-GLUT4HA细胞株，采取电脉冲刺激的方法模拟运动造成的骨骼肌收缩，发现电刺激可以通过激活AMPK增加Rac1的活性，从而磷酸化Akt。Axin1是多功能的支架蛋白，含有与多种分子结合的位点或者结构域，参与了多种生理病理过程，Axin1可能参与到运动调节的AMPK信号通路。本研究用siRNA干扰技术在体外培养的骨骼肌细胞中沉默 Axin1蛋白，探究 Axin1在电刺激作用下调节Akt的分子机制。
　　内容：
　　第一部分：以3T3-L1脂肪细胞作为阳性对照，检测大鼠L6成肌细胞、小鼠C2C12-GLUT4HA肌管细胞和小鼠骨骼肌中Axin1蛋白的表达，检测电刺激对C2C12-GLUT4HA肌管细胞中Axin1蛋白表达的影响。
　　第二部分：采用siRNA下调C2C12-GLUTHA细胞Axin1蛋白表达，检测基因沉默效果，研究siAxin1对电刺激条件下AMPK、PAK、Akt、AS160、PKC的磷酸化水平和Rac1活性的影响，细胞水平上研究AMPK和Axin1的相互关系。
　　第三部分：喂养C57BL/6小鼠到12周龄，将小鼠随机分为对照组、胰岛素刺激组和跑台运动组，检测各组骨骼肌中Axin1的表达，动物实验中研究AMPK和Axin1的相互关系。
　　方法：
　　将小鼠C2C12-GLUTHA骨骼肌细胞分化成肌管细胞，用胰岛素或电脉冲刺激的方法刺激肌管细胞，免疫印迹法检测Axin1蛋白的表达。采用siRNA技术基因沉默Axin1，Western blot检测其对电刺激介导的C2C12-GLUT4HA细胞相关信号分子磷酸化水平变化的影响。12周龄的C57BL/6小鼠随机分为3组①无任何处理的空白对照组②腹腔注射胰岛素组③跑台运动组，免疫印记法测定各组Axin1的表达量，免疫共沉淀的方法测定运动下Axin1和AMPK相互作用。结果：
　　第一部分结果显示：Axin-1在L6成肌细胞、C2C12-GLUT4HA肌管细胞和小鼠骨骼肌中均表达，并且电刺激C2C12-GLUT4HA肌管细胞显著升高Axin1的蛋白水平。
　　第二部分结果显示：当用siRNA技术将C2C12-GLUTHA肌管细胞中Axin1基因沉默后，显著抑制电刺激C2C12-GLUT4HA肌管细胞后升高的AMPK、PAK、Akt和AS160信号分子的磷酸化水平、降低Rac1的活性，但对PKC的磷酸化水平无影响，Axin1和AMPK的免疫共沉淀作用在电刺激的作用下明显加强。
　　第三部分结果显示：运动增加C57BL/6小鼠骨骼肌中Axin1的蛋白表达，并且增强Axin1和AMPK的免疫共沉淀作用。
　　结论：
　　Axin1可能通过与 AMPK形成复合物从而诱导电刺激激活C2C12-GLUT4HA肌管细胞中的Akt，Axin1蛋白可作为改善和治疗胰岛素抵抗新靶点，有待进一步研究。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、电刺激调节的C2C12-GLUT4HA肌管中Axin1蛋白的表达

1.1对象和方法

1.2 结果

1.3小结

二、探讨Axin1蛋白在电刺激激活Akt机制中的作用

2.1 对象和方法

2.2结果

2.3小结

三、研究在C57BL/6小鼠中Axin1和AMPK的相互作用

3.1 对象和方法

3.2 结果

3.3小结

讨论

结论

1、电刺激C2C12-GLUT4HA肌管细胞显著升高Axin1的蛋白水平。

2、Axin1参与电刺激磷酸化Akt的作用。

3、运动增强了C57BL/6小鼠骨骼肌中Axin1和AMPK的免疫共沉淀作用。

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:天然化合物调节骨骼肌葡萄糖的摄取和GLUT4的表达

致谢

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