下调Wnt4、FoxN1后胸腺瘤Thy0517细胞裸鼠成瘤情况及差异基因表达研究

摘要

目的：
　　通过观察下调Wnt4、FoxN1后，胸腺瘤Thy0517细胞在裸鼠体内的成瘤情况，证实Wnt信号通路在胸腺瘤中的作用。并使用基因芯片技术研究下调Wnt4、FoxN1后胸腺瘤 Thy0517细胞的差异基因表达，寻找可能调节 Wnt4及 FoxN1的上下游基因。
　　方法：
　　1.细胞培养及转染
　　用常规方法复苏一株胸腺瘤Thy0517细胞，培养用完全培养基（含10%牛血清），脂质体法分别转染Lipo2000、Wnt986、Fox1069，并用半定量RT-PCR验证Wnt4、FoxN1是否下调，成功转染可进行下一步实验。
　　2.裸鼠成瘤的形态学观察
　　将24只BALB/c裸鼠分为四组：空白组、Lipo2000组、Wnt986组、Fox1069组，并喂养于SPF级动物房中，1周后观察发现所有裸鼠生长状态好，在相应四组裸鼠的右侧腋窝处由同一人将转染成功且处于对数生长期的四组细胞进行皮下接种，出瘤后三天量一次肿瘤体积，接种四周后处死所有裸鼠，测量体积，移除每组中肿瘤体积最大和最小的两只裸鼠，其余取下肿瘤，观察肿瘤形态、称重、绘制生长曲线、制作石蜡切片以备后期做免疫组化。
　　3.基因芯片筛选差异基因
　　提取总RNA进行质检，质检合格后用Agilent基因芯片选出转染Wnt986、Fox1069前后的差异基因，并对其进行GO分析、通路分析，并随机选取部分差异基因,用半定量RT-PCR法检验下调Wnt4、FoxN1后，胸腺瘤Thy0517细胞中相应mRNA表达水平,验证与基因芯片结果是否一致。
　　结果：
　　1、接种3天后四组裸鼠全部有肿瘤生长，肿瘤成分叶状，切面灰白色，质脆，处死裸鼠取瘤后四组裸鼠成瘤的体积分别为：空白组（3.23±0.74）cm2，Lipo2000组（2.86±0.35）cm2，Wnt986组（1.89±0.30）cm2，Fox1069组（1.82±0.40） cm2，空白组与Lipo2000组比差异无统计学意义（P>0.05），Wnt986组、Fox1069组与空白组比较体积减小，差异有统计学意义（P<0.05）；四组裸鼠成瘤的重量分别为：空白组（2.18±0.54）g，Lipo2000组（1.68±0.18）g，Wnt986组（1.53±0.30）g，Fox1069组（1.36±0.28）g，空白组与Lipo2000组比差异无统计学意义（P>0.05），Wnt986组、Fox1069组与空白组比较重量减小，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　2、四组细胞均转染成功。基因芯片结果显示：胸腺瘤Thy0517细胞转染Wnt986后引起的差异基因共有1054个，其中上调631个，下调423个，筛选出7个差异基因经半定量RT-PCR法验证与基因芯片结果比较基本一致，一致率为85.7%，这些差异基因的功能主要集中在生物调节、细胞调控过程、细胞膜、分子功能、结合、细胞成分、生物过程等功能簇，差异基因主要集中的信号通路为哮喘、自身免疫性甲状腺疾病、炎症性肠病、轴突导向、ABC、RAS、MAPK等信号通路；胸腺瘤Thy0517细胞转染Wnt986后引起的差异基因共有1140个，其中上调575个，下调565个，筛选出7个差异基因经半定量RT-PCR法验证与基因芯片结果比较基本一致，一致率为85.7%，这些差异基因的功能主要集中在蛋白激酶B信号、多细胞生物过程、蛋白结合、细胞过程、生物过程、分子功能等功能簇，差异基因主要集中的信号通路为癌症中的转录失调、生理周期、Hedgehog、FOX-O、Hippo等信号通路。
　　结论：
　　1、所有裸鼠接种三天后观察均有瘤体生成，且生长速度较快，说明胸腺瘤Thy0517细胞可以成功建立胸腺瘤裸鼠移植瘤模型并用于实验研究。
　　2、Wnt组和Fox组裸鼠肿瘤生长速度较空白组慢，说明下调Wnt4、FoxN1的胸腺瘤Thy0517细胞致瘤能力减弱，提示Wnt4、FoxN1能促进胸腺瘤的发生，下调Wnt4、FoxN1对胸腺瘤Thy0517细胞裸鼠移植瘤有抑制作用。
　　3、下调 Wnt4、FoxN1后可引起胸腺瘤 Thy0517细胞基因表达谱的广泛改变， Wnt4、FoxN1及其调控的上下游基因并不是通过单独的某一条通路起作用，而是参与到复杂的相互联系的通路网络系统中最终引起胸腺瘤的发生、发展，构建出这个调控网络更有利于揭示胸腺瘤发生的关键基因及其发病机制，对其治疗及预防起关键作用。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

研究对象和方法

1.1 实验对象

1.2 主要仪器设备、器材与试剂

1.3 实验步骤和方法

1.4统计学处理

结果

2.1胸腺瘤Thy0517细胞培养与转染

2.2下调Wnt4、FoxN1后胸腺瘤Thy0517细胞裸鼠成瘤实验

2.3下调Wnt4、FoxN1后胸腺瘤Thy0517细胞裸鼠基因芯片实验

讨论

3.1 Wnt4及FoxN1在胸腺中的表达

3.2 Wnt4及FoxN1在胸腺瘤中的表达情况以及下调Wnt4及FoxN1对裸鼠移植瘤的影响

3.3基因芯片与肿瘤研究

3.4 胸腺瘤中Wnt4与FoxN1的调控关系

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 基因芯片技术在肿瘤研究中的应用

致谢

个人简历