HMGN5在人脑胶质瘤中的表达、功能及分子机制初步研究

摘要

目的： 脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,约占中枢神经系统恶性肿瘤的50%,其中星形细胞瘤约占75%,其复发率和病死率极高.目前,胶质瘤的治疗遵循以手术为主、辅助放化疗的综合治疗原则.由于肿瘤侵袭性强,与周围组织界限不清,目前临床疗效仍不理想,许多患者的生存期低于2年.随着分子生物学研究的不断深入,胶质瘤的个体化靶向治疗是有望取得突破性进展的方向.HMGN5蛋白是高迁移率族核小体结合蛋白(HMGN)家族的一员,通过与核小体相结合引起染色体结构的改变,影响着细胞生物功能和分子转录.最近,一些研究证实,HMGN5在许多人类肿瘤(前列腺癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、骨肉瘤)的发生发展中发挥重要作用.但是,HMGN5在人脑胶质瘤中的表达情况、具体功能及机制尚不明确.探讨胶质瘤组织中HMGN5的表达与临床病理分级的相关性及其在胶质瘤中的具体功能,旨在为胶质瘤的基因靶向治疗提供理论依据. 方法： 1.HMGN5在人脑胶质瘤中的表达及其与临床病理特征的相关性分析 利用RT-PCR检测HMGN5在胶质瘤组织和正常脑组织中的mRNA表达水平;Western blot和免疫组织化学染色检测HMGN5蛋白在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达;制作胶质瘤组织芯片,应用免疫组织化学染色检测HMGN5蛋白的表达,分析其表达情况与病理分级之间的关系. 2.HMGN5对胶质瘤细胞生物学功能的影响 在胶质瘤细胞系U251和U87中应用siRNA瞬时干扰HMGN5蛋白的表达,应用RT-PCR和Western blot检验干扰效率.沉默HMGN5表达后:CCK-8实验检测U251和U87细胞增殖的变化;应用PI单染检测转染后细胞周期的变化;双染法应用流式细胞仪检测细胞凋亡;JC-1染色检查线粒体膜电位变化;细胞划痕和Transwell实验检测U251和U87细胞运动活性的改变(侵袭和迁移能力). 3.HMGN5对胶质瘤细胞生物学作用的体内和机制研究 构建裸鼠皮下荷瘤模型,检测沉默HMGN5表达后胶质瘤细胞体内成瘤及增殖能力的改变;通过Werstern Blot检测沉默HMGN5后对生物学特性相关蛋白(BCL2,CyclinD1,MMP-2,MMP-9Bax,p21)及信号通路分子p-PI3K,p-AKT,p-MEK1和p-ERK1/2的影响. 结果： 1.RT-PCR和Western Blot显示,相对于非肿瘤脑组织HMGN5在mRNA和蛋白水平SNB19、U87、A172、LN229、U251和LN308胶质瘤细胞系中均有稳定表达,且表达量明显呈现高表达状态,差异有统计学意义(P<0.05).免疫组化结果显示,HMGN5在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异显著,具有统计学意义(X2值12.326,P值0.00045).HMGN5表达与胶质瘤病理分级关系:34例低级别(Ⅰ+Ⅱ)胶质瘤中占47.06%;86例高级别(Ⅲ+Ⅳ)胶质瘤中72例高表达,占83.72%.HMGN5在高、低级别胶质瘤中的表达差异显著,具有统计学意义(X2值16.748,P值0.0004). 2.Real-time PCR检测结果表明转染HMGN5siRNA后U251和U87细胞中HMGN5mRNA明显下降,差异有统计学意义;转染HMGN5siRNA后采用CCK8检测U251和U87细胞增殖活性的变化,检测结果显示转染48h和72h后,与对照组相比HMGN5siRNA转染组细胞的吸光度值(OD490)明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);应用PI单染检测转染后细胞周期的变化,沉默HMGN5的表达后,出现明显的G0/G1期阻滞,差异具有统计学意义(P<0.05);双染法应用流式细胞仪检测细胞凋亡,HMGN5的表达可诱导细胞凋亡,差异有统计学意义(P<0.05);通过JC-1染色检测发现沉默HMGN5表达,胶质瘤细胞线粒体膜电位明显降低,细胞早期即发生明显凋亡. 3.应用CCK8检测,HMGN5-siRNA联合替莫唑胺后,抑制胶质瘤增殖活性,相同浓度下较对照组,抑制更为显著,差异具有统计学意义(P<0.05);采用双染和JC-1单染应用流式细胞术检测凋亡和线粒体膜电位的变化,HMGN5-siRNA联合TMZ与TMZ单独处理组和Scramble联合TMZ组相比,细胞凋亡率显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);JC-1检测HMGN5-siRNA联合TMZ处理后线粒体膜电位明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).表明沉默胶质瘤细胞中HMGN5表达后,增加了肿瘤细胞对TMZ的药物敏感性. 4.体外划痕迁移实验结果显示,HMGN5siRNA转染组细胞的间隙存留率明显增高,差异显著具有统计学意义(P<0.05);Transwell迁移、侵袭实验检测显示:HMGN5siRNA转染组平均每视野的穿膜细胞数减少,与对照组差异显著,具有统计学意义(P<0.05). 5.Westernblot检测沉默HMGN5后对生物学特性相关蛋白的表达,结果显示BCL2,CyclinD1,MMP-2,MMP-9等恶性表型相关基因明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);而HMGN5siRNA组的Bax,p21的表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05). 6.应用Werstern Blot通过对PI3K/AKT,MEK/ERK信号通路检测发现,p-PI3K,p-AKT,p-MEK1和p-ERK1/2在HMGN5siRNA组明显降低,差异显著,具有统计学意义(P<0.05). 结论： 1.HMGN5蛋白和mRNA在胶质瘤组织中表达高于正常脑组织;HMGN5蛋白在不同病理级别的胶质瘤中其表达程度差异明显,其表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关. 2.HMGN5-SiRNA可以有效下调HMGN5mRNA和蛋白的水平,沉默胶质瘤细胞中HMGN5表达后,肿瘤细胞的增殖和迁移、侵袭能力下降,细胞凋亡数量增加,同时肿瘤细胞对TMZ的药物敏感性增强. 3.HMGN5可能通过调节PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路引起BCL2,CyclinD1,MMP-2,MMP-9恶性表型相关基因的表达明显降低,而Bax,p21的表达水平明显升高,进而在胶质瘤细胞的增殖、凋亡和迁移、侵袭中发挥作用.

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