BTK在套细胞淋巴瘤中表达的临床意义及其抑制剂BGB-3111联合硼替佐米的协同抗肿瘤效应

摘要

目的：
　　本课题研究目的主要是检测套细胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma,MCL）组织中BTK蛋白的表达水平，并阐明其与患者临床特征及预后的相关性；然后探讨新一代BTK抑制剂BGB-3111单药和联合硼替佐米（bortezomib，BTZ）后对MCL细胞的细胞毒性作用以及诱导凋亡机制的初步研究。期望为新一代BTK抑制剂BGB-3111在MCL患者临床治疗上拓展治疗方案，提高MCL患者的临床预后。
　　方法：
　　1、采用免疫组织化学染色法检测32例MCL患者肿瘤组织中BTK的表达水平，并收集患者的临床病例资料。
　　2、采用SPSS17.0统计学软件分析BTK表达水平与患者临床特征、无进展生存期（progression free survival，PFS）和总生存（overall survival,OS）的相关性。
　　3、细胞学实验中，选用5株MCL细胞系，分别检测其BTK总蛋白的表达水平，根据蛋白WB结果选出3株BTK高表达的MCL细胞系。采用MTS法分别检测BGB-3111、硼替佐米单药对这3株MCL细胞增殖的影响。
　　4、BGB-3111单药处理的MCL细胞经PI染色后，采用流式细胞仪检测BGB-3111单药对MCL细胞周期的影响。
　　5、采用流式细胞仪检测BGB-3111单药处理MCL细胞后经AnnexinV/PI染色，BGB-3111单药对MCL细胞凋亡的影响。
　　6、采用Western blotting分析BGB-3111和依鲁替尼分别对ITK总蛋白表达的影响。
　　7、采用MTS法检测BGB-3111联合硼替佐米对MCL细胞增殖的影响，并用CompuSyn软件分析两药是否具有协同效应。
　　8、采用流式细胞仪检测BGB-3111联合硼替佐米对MCL细胞凋亡的影响。
　　9、采用Western blotting分析BGB-3111联合硼替佐米后，对MCL细胞凋亡相关蛋白表达的影响。
　　10、采用Western blotting分析BGB-3111联合硼替佐米后，对MCL细胞NF-κB信号通路的调控作用。
　　结果：
　　1、免疫组化染色结果显示，BTK蛋白在MCL组织和良性反应性增生淋巴组织中均呈阳性表达；但在良性反应性增生淋巴组织中，BTK呈弱阳性表达并只局限在生发中心外套区；而在MCL组织中呈强阳性表达，其强阳性表达率高达59.4%（19/32）。
　　2、BTK的表达与患者临床特征（性别、年龄、临床分期、骨髓受累、B症状、MIPI评分等）之间的相关性分析显示，BTK的阳性表达与Ki-67和MIPI评分相关，在Ki-67≥30%（χ2=5.783,P=0.019）和MIPI评分≥6分时（χ2=4.522,P=0.038），BTK呈强阳性表达。
　　3、Kaplan-Meier预后相关性分析结果显示，BTK强阳性表达的患者PFS较差，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；但其强阳性表达患者的OS并无显著统计学差异（P=0.073），随访时间有待进一步延长并继续观察。
　　4、PFS的单因素分析结果显示，年龄≥65岁（χ2=11.348,P=0.001）、ECOG评分≥2分（χ2=15.57,P＜0.001）、骨髓受累（χ2=4.138,P=0.042）、BTK强阳性表达（χ2=4.699,P=0.03）、Ki-67≥30%（χ2=4.823,P=0.028）、MIPI评分≥6分（χ2=25.543,P＜0.001）皆是MCL患者的不良预后因素。但由于样本量的限制，在Cox模型多因素分析结果中只发现MIPI评分≥6分是独立的不良预后因素，BTK的强阳性表达尚不能作为MCL患者的独立预后因素。
　　5、细胞增殖实验结果显示，BGB-3111和硼替佐米单药作用Jeko-1、Rec-1、Z138细胞均可抑制细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性；两药分别以2/5IC50~5/5IC50浓度联合后，其联合指数CI均<1，显示较低浓度的两药联合对MCL细胞的增殖抑制作用具有协同效应。
　　6、细胞周期实验结果显示，BGB-3111单药作用MCL细胞48h后，可剂量依赖性诱导MCL细胞阻滞在G0/G1期，1uM BGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后，G0/G1期百分比为27.02%~40.14%；2uM BGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后，G0/G1期百分比为33.44%~46.82%；3uM BGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后，G0/G1期百分比为42.97%~59.04%。
　　7、细胞凋亡实验结果显示，BGB-3111单药作用MCL细胞48h后可诱导细胞凋亡，并呈剂量依赖性；3uM BGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后，细胞凋亡率为7.4%~22.4%，6uM BGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后，细胞凋亡率为15.4%~37.2%，9uM BGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后，细胞凋亡率为30%~59.1%；低浓度即2/5 IC50 BGB-3111联合2/5 IC50 BTZ作用MCL细胞48h后，联合治疗组凋亡率较单药治疗组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　8、Western blotting检测结果显示，Ibrutinib可降低 ITK总蛋白的表达，而BGB-3111对ITK缺乏选择性。
　　9、Western blotting检测结果显示，BGB-3111可抑制PARP总蛋白表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时促进了cleaved caspase-9蛋白表达，提示其对应蛋白裂解增加，从而诱导细胞凋亡；联合BTZ后，增强其作用。
　　10、Western blotting检测结果显示，BGB-3111发挥以上功能可能是通过下调MCL细胞BTK蛋白的磷酸化，进一步抑制IKBa和P65的磷酸化，影响NF-κB核转录来实现的。联合BTZ后，增强其作用。
　　结论：
　　1、BTK蛋白在MCL组织中呈强阳性表达，且强阳性表达患者与Ki-67和MIPI评分显著相关。
　　2、BTK强阳性表达的患者与弱阳性表达患者相比PFS明显缩短（P=0.03），而OS确无统计学差异，有待进一步延长随访时间。
　　3、PFS预后单因素分析显示，BTK强阳性表达是影响MCL患者的不良预后因素（P=0.03），但多因素分析显示，在本研究有限的样本中观察到BTK强阳性表达尚不能作为MCL患者的独立预后因素。
　　4、BGB-3111可抑制 MCL细胞增殖，并呈时间和剂量依赖性；较低浓度联合BTZ，可协同增强抑制MCL增殖。
　　5、BGB-3111可诱导MCL细胞阻滞在G0/G1期。
　　6、BGB-3111相比 Ibrutinib对ITK分子缺乏选择性，相对于BTK具有更高的特异性，具有更好的限制性脱靶活性
　　7、BGB-3111可促进MCL细胞凋亡；较低浓度联合BTZ，可协同诱导细胞凋亡。
　　8、BGB-3111可抑制MCL细胞PARP总蛋白，下调Bcl-2表达，同时促进cleaved PARP和cleaved caspase-9蛋白表达；联合BTZ，可协调增强其作用。
　　9、BGB-3111诱导以上功能变化是通过下调BTK活性、抑制IKBa和P65的磷酸化，进而调控NF-κB活性来实现的；联合BTZ，可协调增强其调控作用。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、BTK蛋白的表达与MCL患者预后的关系

1.1对象和方法

1.2结果

1.3 讨论

1.4小结

二、BTK抑制剂BGB-3111对MCL细胞的作用及机制初步研究

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: Bruton酪氨酸激酶抑制剂在B细胞恶性肿瘤的研究进展

致谢

个人简历