骨髓间充质干细胞培养上清液对大鼠角膜碱烧伤修复的实验研究

摘要

目的：
　　角膜碱烧伤是常见的、治疗较为棘手的角膜外伤，碱烧伤后不同的临床阶段，组织反应不同。急性期以炎症反应为特征，早期修复期以上皮细胞、基质细胞及细胞外基质的修复为主；目前临床上治疗碱烧伤多采用抗炎、抑制免疫反应、角膜移植等方法，但疗效不甚理想。骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells BMSCs）是一种具有高度自我更新能力、多向分化潜能和免疫调节特性的成体干细胞。BMSCs能够合成分泌多种细胞因子，并可通过旁分泌效应促进受损细胞或组织修复。目前国内外研究已经证明BMSCs能够促进碱烧伤后角膜修复，但由其分泌的细胞因子的治疗作用，尚待进一步研究证明。本课题通过建立大鼠角膜碱烧伤模型，探讨骨髓间充质干细胞培养上清液（Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium MSC-CM）在碱烧伤后角膜上皮愈合、角膜混浊程度、组织炎症反应、基质纤维化、细胞增殖和凋亡中的作用。
　　方法：
　　1.建立大鼠角膜碱烧伤模型:将直径4mm的单层滤纸片在1mol/L NaOH溶液中浸泡后，贴附于角膜中央10秒，损伤后治疗组给予MSC-CM局部点眼，对照组给予磷酸盐缓冲液（Phosphate-Buffer Saline PBS）点眼，大鼠饲养周期为14天，比较不同时间点两组角膜修复情况；
　　2.裂隙灯观察碱烧伤后大鼠眼表的变化情况：分别于碱烧伤后12小时、24小时、48小时、3天、5天、7天、10天、14天，观察角膜上皮愈合情况，并计算上皮缺损面积百分比（荧光素钠染色，钴蓝光下观察）；分别于碱烧伤后48小时、3天、5天、7天、10天、14天，观察中央角膜混浊度，并根据Fantes评分系统进行评分；
　　3.组织病理学检查：分别于碱烧伤后12小时、24小时、48小时、3天、7天、14天，通过 HE染色观察损伤后角膜组织形态学改变及炎症细胞浸润情况；分别于碱烧伤后24小时、48小时、3天、7天、14天，通过免疫组织化学染色，观察碱烧伤后大鼠角膜细胞增殖（PCNA）、基质纤维化(α-SMA)及细胞凋亡(Caspase-3)情况，并对阳性细胞进行计数；
　　4.实时定量-聚合酶链锁反应（RT-PCR）：分别于碱烧伤后12小时、24小时、48小时、3天、7天、14天，通过RT-PCR检测不同时间点炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-10）、基质纤维化因子（α-SMA、Collage-Ш、Collage-?）、细胞增殖因子（PCNA）、细胞凋亡因子（Bax、Bcl2、Caspase-3）的基因表达情况。
　　结果：
　　1.碱烧伤后24小时、48小时、3天、5天、7天，MSC-CM治疗组角膜上皮缺损面积百分比小于PBS对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），MSC-CM治疗组角膜上皮于损伤后第7天完全愈合，PBS对照组角膜上皮于损伤后第10天完全愈合；碱烧伤后48小时、3天、5天、7天、10天，两组角膜混浊度评分比较，差异没有统计学意义，MSC-CM治疗组于损伤后第10天角膜完全透明，PBS对照组于损伤后第14天角膜完全透明；
　　2. HE染色结果：碱烧伤后24小时、48小时、3天、7天，MSC-CM治疗组角膜上皮细胞层数，基质水肿程度，胶原纤维排列规整程度均优于 PBS对照组，基质炎症细胞计数均少于PBS对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）；
　　3.免疫组织化学染色结果：碱烧伤后24小时、48小时、3天、5天、7天，PCNA阳性细胞计数 MSC-CM治疗组均多于 PBS对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；碱烧伤后24小时、48小时、3天、5天、7天、14天，α-SMA阳性细胞计数 MSC-CM治疗组均少于 PBS对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；碱烧伤后4小时、48小时、3天、5天、7天，Caspase-3阳性细胞计数MSC-CM治疗组均少于PBS对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；
　　4. RT-PCR结果：碱烧伤后12小时、24小时、48小时、3天、7天，MSC-CM治疗组 TNF-α（P<0.01）、IL-6（P<0.05）、α-SMA（P<0.001）、Collage-Ш（P<0.01）、Bax（P<0.01）、Caspase-3（P<0.001）基因表达水平低于 PBS对照组，IL-10（P<0.05）、PCNA（P<0.001）、Collagen-?（P<0.001）、Bcl2（P<0.01）基因表达水平高于PBS对照组，差异具有统计学意义。碱烧伤后第14天，MSC-CM治疗组TNF-α、Bax、Caspase-3、Bcl2基因表达水平与PBS对照组比较，差异没有统计学意义；IL-6（P<0.05）、α-SMA（P<0.001）、Collage-Ш（P<0.01）基因表达水平仍低于 PBS对照组，IL-10（P<0.05）、PCNA（P<0.001）、Collagen-?（P<0.001）基因表达水平仍高于PBS对照组，差异具有统计学意义。因子TNF-α和IL-6基因表达，同时促进抗炎因子IL-10基因表达有关；
　　结论：
　　1. MSC-CM能抑制碱烧伤后角膜基质纤维化，这可能与其能够抑制α-SMA和Collagen-Ш基因和蛋白表达，同时促进Collagen-?基因表达有关；
　　2. MSC-CM能够抑制碱烧伤后角膜细胞凋亡，这可能与其能够促进凋亡抑制基因Bcl2基因表达，并抑制凋亡诱导基因Bax、Caspase-3基因/蛋白表达有关。

目录

声明

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1对象和方法

1.1实验动物

1. 2主要仪器和设备

1. 3主要试剂

1. 4主要试剂的配制

1. 5分组和碱烧伤模型制作

1. 6角膜上皮愈合情况和角膜混浊度评分

1. 7 HE染色组织学

1. 8免疫组织化学染色

1. 9逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

1. 10统计学方法

2 结果

2.1角膜上皮愈合情况

2.2角膜混浊度评分

2.3 HE染色

2.4免疫组织化学染色

2.5 RT-PCR检测相关细胞因子的基因表达情况

3讨论

3.1角膜损伤修复的组织学基础

3.2BMSCs的旁分泌作用与损伤修复的关系

3.3MSC-CM对碱烧伤后角膜上皮层愈合的影响

3.4MSC-CM对碱烧伤后角膜炎症反应的影响

3.5MSC-CM对碱烧伤后角膜基质纤维化的影响

3.6MSC-CM对碱烧伤后角膜组织细胞凋亡的影响

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:间充质干细胞合成的旁分泌因子在角膜损伤修复中的作用研究进展

致谢

个人简历