阿司匹林调控生长分化因子15蛋白表达对心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用及作用机制的初步研究

摘要

心肌缺血再灌注（I/R）损伤是心脏缺血恢复血流灌注后损伤加重的现象，其损伤细胞死亡本质与细胞凋亡相关。近年来发现在心绞痛冠脉解痉、心肺脑复苏等情况下均有I/R发生，是造成术后病人病情恶化的重要原因之一，因此寻找减轻 I/R的方法已成为一个新的研究热点。GDF15作为一种应激反应蛋白，生理情况下在前列腺和胎盘中高表达，在其他大多数组织中微量表达；但在生理病理和环境应激情况下，如I/R损伤、动脉粥样硬化、心脏高压力负荷和心力衰竭，GDF15在心肌细胞中均大量表达，对心肌细胞的结构和凋亡发挥调节作用。因此，GDF15可以被看做心血管疾病的标志物。
　　目的:
　　首先构建 GDF15慢病毒表达载体，包装病毒，建立 GDF15稳定过表达的心肌细胞株，之后检测GDF15蛋白对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤凋亡的保护性作用及对自噬的影响；继而阿司匹林（Asp）预处理观察 H9c2心肌细胞H/R后GDF15的表达水平，以及Asp通过提高GDF15蛋白表达对细胞凋亡的保护性作用和对自噬的影响。明确GDF15蛋白以及Asp心肌保护作用的机制，为其临床应用提供理论依据。
　　方法：
　　第一部分
　　1. GDF15稳定过表达细胞株H9c2/GDF15的建立
　　构建慢病毒表达载体 pCDH-CMV-MCS-GDF15-EF1-Puro，和空白载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro分别与pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2. G包装慢病毒，感染H9c2细胞，嘌呤霉素筛选，最终得到GDF15稳定过表达心肌细胞株H9c2/GDF15及对照细胞株H9c2/Sham。
　　2.建立H9c2细胞H/R损伤模型
　　H9c2细胞生长至铺满80%~90%时，换用模拟缺氧溶液，放入密闭缺氧装置充氮气30 min，在培养箱中模拟缺血，4 h后换用无血清正常培养基模拟再灌注，培养箱中分别复氧2 h、3 h、4 h后，MTT法检测各时间点细胞活性，筛选出最适合的复氧时间点，定为实验中H/R条件，建立H9c2心肌细胞H/R模型。
　　3.检测过表达GDF15对H9c2的影响
　　检测H/R后H9c2/GDF15及对照细胞株H9c2/Sham细胞存活率、细胞培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）活力测定、凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax和自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达。
　　第二部分
　　1. Asp对H9c2细胞H/R损伤的影响
　　不同浓度Asp预处理H9c2心肌细胞后进行H/R处理，MTT法检测Asp干预后的细胞与未干预的细胞的存活率变化，选择适合的复氧时间点。
　　2. Asp预处理后细胞GDF15表达的变化
　　不同浓度Asp干预H/R前后的H9c2细胞，利用Western Bolt检测各组细胞GDF15蛋白表达水平。
　　3.凋亡和自噬相关蛋白的表达
　　检测各组凋亡相关蛋白 Caspase-3、Bcl-2、Bax和自噬相关蛋白 Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达水平。
　　结果：
　　第一部分
　　1.成功构建大鼠GDF15慢病毒表达载体，包装病毒，建立大鼠心肌GDF15过表达细胞株H9c2/GDF15
　　正确构建慢病毒表达载体 pCDH-CMV-GDF15-EF1-Puro，建立大鼠 GDF15稳定过表达心肌细胞株，与H9c2/Sham组相比，H9c2/GDF15组中GDF15基因mRNA表达水平高6.3倍；GDF15蛋白表达明显增加。证明大鼠GDF15过表达H9c2细胞株构建成功。
　　2.过表达GDF15对H9c2的影响
　　MTT结果显示，在缺氧4h后，对H9c2/GDF15和H9c2/Sham心肌细胞进行2 h、3 h、4 h的复氧干预，各时间点H9c2/GDF15细胞活性均较H9c2/Sham高，存在显著性差异（P<0.01）。
　　细胞培养上清中LDH活力值，相较于H9c2/Sham组，H9c2/GDF15组在H/R后LDH活力值明显降低，存在显著差异（P<0.01）。
　　3. GDF15过表达对H/R所诱发的细胞凋亡的影响
　　Western Blot检测显示，在H/R2 h时，与H9c2/Sham组相比，H9c2/GDF15组的Caspase-3表达明显减少，具有显著性差异（P<0.01）；Bcl-2/Bax值显著增加，具有显著性差异（P<0.01）。
　　4. GDF15过表达对H/R所诱发的细胞自噬的影响
　　Western Blot检测显示，缺氧4 h后，与H9c2/Sham组相比，H9c2/GDF15组 Beclin-1表达明显增加，具有显著性差异（P<0.01），在 H/R2 h时，与H9c2/Sham组相比，H9c2/GDF15组Beclin-1表达明显增加，具有显著性差异（P<0.01）；同样，LC3Ⅱ的表达明显增加，具有显著性差异（P<0.01）。
　　第二部分
　　1. Asp干预对H9c2细胞H/R损伤的影响
　　MTT结果显示，随着Asp浓度的不断增加，H9c2-Asp-H/R和H9c2-H/R细胞存活率均呈递减趋势，但在相同浓度下，相较于H9c2-H/R组，H9c2-Asp-H/R组细胞存活率增高，具有显著性差异（P<0.01）。
　　2. Asp预处理对H9c2细胞H/R损伤后GDF15表达的影响
　　不同浓度的Asp预处理各组细胞48h后行H/R2h、3h、4h，在复氧2h时，相较于H9c2-H/R组，H9c2-Asp-H/R组GDF15的表达显著增加，具有统计学意义（P<0.01）。
　　3. Asp预处理对H9c2细胞H/R损伤后凋亡与自噬的影响
　　用不同浓度Asp预处理各组H9c2细胞，相较于H9c2-H/R组，H9c2-Asp-H/R组Caspase3蛋白表达显著减少（P<0.01），Bcl-2/Bax的比值明显增加（P<0.01）， Beclin-1的表达显著增加（P<0.01），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明显增加（P<0.01）。结论：
　　1.成功构建GDF15稳定过表达心肌细胞株H9c2/GDF15及其阴性空载体对照细胞株H9c2/Sham。
　　2.上调大鼠心肌细胞H9c2的GDF15蛋白水平可保护心肌细胞，减轻H/R损伤，其保护性作用机制可能通过促进细胞的自噬作用得以实现。
　　3. Asp预干预可增加GDF15的表达，提高细胞的自噬程度，从而减轻H/R所诱发的细胞损伤。

目录

声明

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、大鼠GDF15蛋白过表达对心肌H/R损伤的保护性作用及与自噬间关系的研究

1.1实验材料

1.2 实验方法

1.3 结果

1.4 小结

1.5 讨论

二、阿司匹林对GDF15表达和心肌细胞H/R损伤的影响

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 小结

2.5 讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:GDF15在心血管疾病中的研究进展

致谢

个人简历