脊髓PN-DMT1（-）IRE-铁聚积通路在瑞芬太尼诱导的术后痛觉过敏中的作用研究

摘要

瑞芬太尼作为超短效μ阿片受体激动剂，具有起效迅速、清除快的特点，是目前临床上常用的镇痛药，但其可诱发术后痛觉过敏，影响患者的预后。明确瑞芬太尼诱发痛觉过敏的机制有助于制定有效的防治策略。过氧亚硝酸根阴离子（peroxynitrite, PN）是由过氧化物和一氧化氮反应生成，是一种强效的活性氮自由基，PN是介导疼痛的一个重要因素。二价金属离子转运体1（divalent metal transporter1, DMT1）是细胞主要的摄铁蛋白，在中枢神经系统铁代谢中起着关键性的作用。研究表明， DMT1介导的铁聚积参与N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体的神经毒性作用，同时这种毒性作用能被选择性铁鳌合剂有效阻断，而NMDA受体激活是阿片类药物诱发的痛觉过敏的重要机制之一。铁是人体必不可少的微量金属元素之一，铁稳态对于维持脑的正常生理功能极为重要。中枢神经系统内神经元的活动特别依赖需氧代谢，铁离子在细胞呼吸过程中介导线粒体内的电子传递，影响神经元突触兴奋性电活动。本研究拟利用大鼠Brennan切口痛的动物模型，分别探讨脊髓内PN以及铁代谢在瑞芬太尼诱导的术后痛觉过敏中的作用，为明确其发病机制提供参考，也为临床防治阿片类药物诱发的痛觉过敏提供新的特异性防治策略。
　　第一部分：脊髓PN在瑞芬太尼诱导的术后痛觉过敏中的作用研究。
　　目的：评价脊髓PN在瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏中的作用。
　　方法：成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠32只，体重240~260 g，采用随机数字表法分为4组（n=8），对照组（C组）：经尾静脉输注生理盐水0.1 ml?kg-1?min-160 min；切口痛组（I组）：建立大鼠切口痛模型；瑞芬太尼组（R组）静脉输注瑞芬太尼1.0μg?kg?1?min?160 min；切口痛+瑞芬太尼组（I+R组）建立大鼠切口痛模型，同时静脉输注瑞芬太尼1.0μg?kg?1?min?160 min。分别于静脉输注生理盐水或瑞芬太尼前24 h、输注结束后6、24和48 h（T0-3）时测定机械缩足反应阈（paw withdrawal threshold, PWT）和热缩足潜伏期（paw withdrawal latency, PWL）。最后一次测定痛阈后处死大鼠，取L4-6脊髓组织，采用Western blot法测定3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）的表达，采用免疫共沉淀联合Western blot法测定硝化的锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase, MnSOD）的表达。然后再采用黄嘌呤氧化酶法测定脊髓MnSOD和铜锌超氧化物歧化酶（copper/zinc superoxide dismutase, CuZnSOD）的活性。
　　结果：与C组比较，I组、R组和I+R组T1-3时PWT降低，PWL缩短，脊髓3-NT和硝化MnSOD表达上调，MnSOD活性降低（P<0.05）；与I组和R组比较，I+R组T1-3时PWT明显降低，PWL明显缩短，脊髓3-NT和硝化MnSOD的表达显著上调，MnSOD的活性降低（P<0.05）；但各组间CuZnSOD的活性差异无统计学意义（P>0.05）。
　　结论瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏可能与脊髓中PN过表达，进一步硝化MnSOD使其失活有关。
　　第二部分：DMT1和铁代谢在瑞芬太尼诱导的术后痛觉过敏中的作用研究。
　　目的：评价瑞芬太尼诱发切口痛大鼠痛觉过敏时脊髓内DMT1的表达和铁含量的变化。
　　方法：成年雄性SD大鼠32只，体重240~260 g，2~3月龄，采用随机数字表法分为4组（n=8）：对照组（C组）静脉输注生理盐水0.1 ml?kg-1?min-160 min；切口痛组（I组）建立大鼠切口痛模型；瑞芬太尼组（R组）静脉输注瑞芬太尼1.0μg?kg?1?min?160 min；切口痛+瑞芬太尼组（I+R组）建立大鼠切口痛模型，同时静脉输注瑞芬太尼1.0μg?kg?1?min?160 min。于静脉输注生理盐水或瑞芬太尼结束后48小时处死大鼠，取L4-6脊髓组织，采用Western Blot法和免疫组织化学法测定DMT1(-)IRE和DMT1(+)IRE的表达；采用普鲁士蓝铁染色法和原子吸收分光光度计法测定脊髓中的铁含量。
　　结果：与C组比较，I组、R组和I+R组脊髓DMT1(-)IRE表达上调（P<0.05）；与I组和R组比较，I+R组脊髓DMT1(-)IRE表达也明显上调（P<0.05）。然而，各组间DMT1(+)IRE的表达差异无统计学意义（P>0.05）。与C组比较，I组、R组和I+R组脊髓铁含量升高（P<0.05）；与I组和R组比较，I+R组脊髓铁含量明显升高（P<0.05）。
　　结论：瑞芬太尼诱发切口痛大鼠痛觉过敏的机制可能与脊髓DMT1(-)IRE激活，诱导铁聚积有关。
　　第三部分：富氢液和铁鳌合剂对瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏的影响研究。
　　目的：分别探讨不同浓度富氢液和铁鳌合剂对瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏的影响。
　　方法：尾静脉置管成功的雄性SD大鼠，体重240~260 g，采用随机数字表法分为5组（n=8）：对照组（C组）尾静脉输注生理盐水0.1 ml?kg-1?min-160 min；切口痛+瑞芬太尼组（I+R组）建立大鼠切口痛模型，尾静脉输注瑞芬太尼1.0μg?kg?1?min?160 min；富氢液组（10 ml/kg H组）尾静脉输注生理盐水0.1 ml?kg-1?min-160 min，静脉输注前10 min经腹腔给予10 ml/kg富氢液；切口痛+瑞芬太尼组+不同浓度富氢液组（I+R+2.5 ml/kg H, I+R+5 ml/kg H, I+R+10 ml/kg H组）建立大鼠切口痛模型，尾静脉输注瑞芬太尼1.0μg?kg?1?min?160 min，静脉输注前10 min分别经腹腔给予2.5,5,10 ml/kg富氢液。分别于静脉输注前24 h、输注结束后6、24和48 h（T0-3）时，采用行为学方法分别测定PWT和PWL。
　　尾静脉置管成功的雄性SD大鼠，体重240~260 g，采用随机数字表法分为5组（n=8）：对照组（C组）尾静脉输注生理盐水0.1 ml?kg-1?min-160 min；切口痛+瑞芬太尼组（I+R组）建立大鼠切口痛模型，尾静脉输注瑞芬太尼1.0μg?kg?1?min?160 min；铁鳌合剂组（10μg SIH组）尾静脉输注生理盐水0.1 ml?kg-1?min-160 min，静脉输注前10 min经腹腔给予10μg铁鳌合剂SIH；切口痛+瑞芬太尼组+不同浓度铁鳌合剂组（I+R+1μg SIH, I+R+5μg SIH, I+R+10μg SIH组）建立大鼠切口痛模型，尾静脉输注瑞芬太尼1.0μg?kg?1?min?160 min，静脉输注前10 min分别经腹腔给予1,5,10μg铁鳌合剂SIH。分别于静脉输注前24 h、输注结束后6、24和48 h（T0-3）时，采用行为学方法分别测定PWT和PWL。
　　结果：与C组比较，I+R组T1-3时PWT明显降低，PWL明显缩短（P<0.05）；与I+R组比较，I+R+2.5 ml/kg H, I+R+5 ml/kg H和I+R+10 ml/kg H组PWT明显升高，PWL明显延长，且随着富氢液含量的增加，PWT升高和PWL延长得更加明显（P<0.05）。与I+R组比较，I+R+1μg SIH, I+R+5μg SIH, I+R+10μg SIH组PWT明显升高，PWL明显延长，且随着铁鳌合剂含量的增加，PWT和PWL也呈相应的剂量依赖性改变（P<005）。
　　结论：富氢液和铁鳌合剂分别能有效预防瑞芬太尼诱发的术后痛觉过敏，并且防治效果呈剂量依赖性。
　　第四部分：PN-DMT1(-)IRE-铁聚积通路可能是瑞芬太尼诱发大鼠痛觉过敏的重要发病机制之一。
　　目的：评价PN过表达和DMT1(-)IRE诱导的铁聚积在瑞芬太尼诱发大鼠痛觉过敏中的关系。
　　方法：健康成年雄性SD大鼠32只，体重240~260 g，采用随机数字表法分为4组（n=8）：对照组（C组）尾静脉输注生理盐水0.1 ml?kg-1?min-160 min；瑞芬太尼组（R组）尾静脉输注瑞芬太尼1.0μg?kg?1?min?160 min；富氢液组（C+H组）：尾静脉输注生理盐水0.1 ml?kg?1?min?1，静脉输注前10 min腹腔注射富氢液10 ml/kg；瑞芬太尼+富氢液组（R+H组）：尾静脉输注瑞芬太尼1.0μg?kg?1?min?160 min，静脉输注前10 min腹腔注射富氢液10 ml/kg。于静脉输注结束后48 h处死大鼠，取L4-6脊髓组织，采用Western Blot检测脊髓组织中PN，DMT1(-)IRE的表达情况，采用普鲁士蓝铁染色法和原子吸收分光光度计法测定脊髓中的铁含量。
　　结果：与C组比较，R组PN，DMT1(-)IRE的表达明显增加，脊髓铁含量也明显升高（P<0.05）；C+H组各指标均无明显改变（P>0.05）；与R组比较，R+H组PN，DMT1(-)IRE的表达明显减少，脊髓铁含量明显降低（P<0.05）。
　　结论：PN过表达，通过激活下游分子DMT1(-)IRE，引发脊髓组织内铁聚积，可能是瑞芬太尼诱发大鼠痛觉过敏的重要发病机制之一。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、脊髓PN在瑞芬太尼诱发大鼠痛觉过敏中的作用研究

1.1对象和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

第二部分：DMT1和铁代谢在瑞芬太尼诱发大鼠痛觉过敏中的作用研究

2.1对象和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4小结

第三部分：富氢液和铁鳌合剂对瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏的影响研究

3.1对象和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四部分：脊髓PN过表达和DMT1(-)IRE诱导的铁聚积在瑞芬太尼诱发大鼠痛觉过敏中的关系研究

4.1对象和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:铁积聚神经毒性作用的研究进展

致谢

个人简历

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