miR-497调控CDK6,PlexinA4影响喉鳞状细胞癌生长的实验研究

摘要

目的：查询喉鳞状细胞癌microRNA表达谱，选定miR-497进行研究；研究miR-497和CDK6、PlexinA4在喉鳞癌及癌旁正常黏膜新鲜标本和细胞株中的表达情况及相关性，结合临床病理参数评价它们的临床意义及与预后的关系；利用生物信息学方法预测miR-497下游靶基因,随后验证；研究miR-497对喉鳞癌细胞增殖、克隆、侵袭和细胞周期的影响及CDK6、PlexinA4对喉鳞癌细胞增殖、克隆、侵袭和细胞周期的影响，明确它们的生物学功能。
　　方法：利用qRT-PCR和免疫组织化学方法在喉鳞癌及癌旁正常黏膜新鲜标本中观察miR-497和靶基因CDK6、PlexinA4表达情况；将miR-497和CDK6、PlexinA4表达情况与临床病理参数、术后随访资料相结合，评价它们的临床意义及与预后的关系；通过生物信息学预测miR-497的靶基因CDK6、PlexinA4，利用双荧光素酶报告基因检测的方法验证它们的靶向调控关系；利用基因转染技术将miR-497模拟物转染至喉鳞癌细胞，通过MTT法、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell法、流式细胞术等技术手段，观察miR-497对喉鳞癌细胞生物学功能的影响；通过裸鼠移植瘤模型观察miR-497抑制肿瘤效果；采用RNA干扰技术将CDK6siRNA、PlexinA4siRNA转染至喉鳞癌细胞，通过MTS法观察CDK6 siRNA、PlexinA4 siRNA对喉鳞癌细胞增殖的影响；通过过表达实验构建pcDNA3.1(+)CDK6，pcDNA3.1(+)PlexinA4过表达质粒转染至喉鳞癌细胞，通过MTS法观察pcDNA3.1(+)CDK6，pcDNA3.1(+)PlexinA4对喉鳞癌细胞增殖的影响。结果：miR-497喉鳞癌中低表达，在中低分化喉鳞癌中，以及有远处转移的喉鳞癌中miR-497低表达例数在所占百分比显著增高（P<0.05），相反，在高分化以及无远处转移组中miR-497低表达例数所占百分比显著降低（P<0.05）；miR-497的表达情况与年龄、性别、原发部分、T分期、肿瘤大小及术前吸烟均无统计学差异（P>0.05）。CDK6及PlexinA4在喉癌中高表达。miR-497与CDK6,PlexinA4表达在喉鳞癌中呈负相关关系。经 Kaplan-Meier法行生存分析并进行Log-rank检验，miR-497高表达组患者的预后好于miR-497低表达组，差异有统计学意义（χ2=10.342，P=0.001）；Cox回归分析显示miR-497低表达的相对危险度为2.262（95%CI为0.151~0.732，P=0.033），是喉鳞癌患者预后的独立影响因素。野生型（CDK6 Wt3’-UTR组，plexinA4 Wt3’-UTR组）荧光活性变化倍数与对照组的荧光活性变化倍数相比，差异有统计学意义（P<0.01）。而突变型（CDK6 Mut3’-UTR组，plexinA4 Mut3’-UTR组）组的荧光活性倍数与对照组的荧光活性变化倍数比较，差异无统计学意义（P>0.05）。体外实验中，miR-497 mimics作用Hep-2、TU-212细胞后，细胞生长受到明显抑制，平板克隆形成能力受到遏制，G0/G1细胞数百分比增加，差异均有统计学意义（均P<0.05）。体内实验中，miR-497 agomir实验组肿瘤生长速度较NC agomir对照组及Blank空白对照组慢，差异有统计学意义（P<0.01）。CDK6 siRNA2以及plexinA4 siRNA2作用Hep-2、TU-212细胞后，细胞生长受到明显抑制，差异均有统计学意义（P<0.05）。pcDNA3.1(+)/CDK6以及pcDNA3.1(+)/plexinA4组作用后的Hep-2、TU-212细胞生长受到明显促进，穿过小室的迁移细胞数目明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P<0.01）。
　　结论：
　　1、miR-497在喉鳞癌中显著下调，具有抑癌基因的作用，而CDK6、PlexinA4在喉鳞癌组织中显著升高，具备癌基因作用。同时伴有miR-497低表达的个体预后不良，且这一分子特征是喉鳞癌患者预后的独立危险因素。
　　2、CDK6,PlexinA4是miR-497的靶基因，miR-497对CDK6、PlexinA4存在靶向调控作用。
　　3、在体外miR-497对于喉鳞癌细胞增殖、克隆、迁移和侵袭有抑制作用，可将细胞周期阻滞于G0/G1期。在体内可以抑制裸鼠皮下荷Hep-2瘤的生长。
　　4、CDK6 siRNA，PlexinA4 siRNA对于喉鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭有抑制作用。
　　5、pcDNA3.1(+)/ CDK6和pcDNA3.1(+)/ PLEXINA4对于喉鳞癌细胞增殖、侵袭以及克隆形成能力有正向促进作用。并促进喉鳞癌细胞进入S期。
　　6、miR-497通过调控其靶基因 CDK6、PlexinA4参与了喉鳞癌的发生发展，为揭示喉鳞癌的发病机制提供新的理论依据，可为喉鳞癌的治疗提供新的分子靶点。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、miR-497与CDK6,Plexin-A4在喉鳞癌中的表达研究

1.1对象和方法

1.2 结果

1.3讨论

1.4小结

二、miR-497靶向调节CDK6,PlxinA4

2.1 对象和方法

2.2 实验结果

2.3讨论

2.4小结

三、miR-497对喉鳞癌细胞体外功能以及体内肿瘤生长的影响

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

四、敲低CDK6、PlexinA4后对喉鳞癌细胞恶性表型的影响研究

4.1对象和方法

4.2 结果

4.3讨论

4.4小结

五 过表达CDK6、PlexinA4后对喉鳞癌细胞恶性表型的影响研究

5.1对象和方法

5.2实验结果

5.3讨论

5.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:miRNA497在肿瘤中的进展

致谢

个人简历