胆酸与宿主肠道菌群互作在肠腺瘤恶变中的机制研究

摘要

目的
　　肠癌是导致癌症患者死亡的主要疾病之一。肠癌的主要癌前疾病是肠道腺瘤(约占全部肠癌癌前疾病的90%～95%)，腺瘤性息肉病基因（adenomatous polyposis coli，Apc）的突变普遍被认为是肠癌发生发展过程中的早期事件。临床发现，高脂饮食可导致肝脏合成胆汁酸的底物（胆固醇）增加，进而引发肠腔中胆汁酸流量增加，过量的胆汁酸无法全部在回盲部通过肠肝循坏回吸收，而是会有部分进入结肠。最新研究还发现高脂饮食可诱导肠道菌群失衡，引起多种显著的肠道菌群丰度改变及机体内环境紊乱。初级胆汁酸胆酸（cholic aicd, CA）是人类最主要胆汁酸之一，一方面，其代谢受到肠道菌群的影响，另一方面，其代谢产物也影响着肠道菌群，而肠道菌群与胆汁酸的相互作用在肠癌发生发展中的作用尚不完全明确。本研究以能自发形成肠道腺瘤的Apcmin/+小鼠为模型，探讨在肠道腺瘤恶变过程中胆汁酸与肠道菌群的相互作用。
　　方法
　　第一部分：为了探讨 CA对 Apcmin/+小鼠肠道腺瘤恶变的作用，我们以4周龄Apcmin/+小鼠为研究对象，分为胆酸组（饮食中添加0.4%CA）和对照组（普通饮食），饲养周期为12周，处死小鼠，分离全部肠道组织，分段记录腺瘤数量及大小，病理学评估腺瘤恶变情况； Realtime-PCR、免疫荧光、免疫组织化学染色检测小鼠肠道单核-巨噬系统改变；免疫组织化学观察腺瘤恶变过程中Wnt信号通路关键信号分子表达的变化。
　　第二部分：饲养12周后，处死小鼠前给予小鼠FITC-D灌胃，采取眼球血检测血清FITC-D浓度以评价肠道通透性，收集新鲜粪便进行肠道菌群16S rRNA测序及色谱法检测各种胆汁酸水平；处死小鼠，采取回盲部粪便色谱法检测短链脂肪酸水平；Realtime-PCR、免疫组织化学染色评价肠道紧密连接蛋白、杯状细胞及潘氏细胞功能；Realtime-PCR检测肠道炎症水平。
　　第三部分：为评价抗生素去除肠道菌群对CA诱导Apcmin/+小鼠肠癌的阻断作用，我们对胆酸组小鼠同时给予抗生素鸡尾酒（万古霉素100mg/L、氨苄西林200mg/L、新霉素200mg/L和甲硝唑200mg/L）以去除肠道菌群作用，余实验动物处理同上，此时实验动物为三组：胆酸组，胆酸+抗生素组，对照组，12周后处死小鼠，计数肠道腺瘤数目及大小，病理学组织学观察腺瘤恶变情况，Realtime-PCR检测肠道炎症。
　　第四部分：为深入研究胆酸及其导致的肠道菌群改变对IL-6/STAT3信号通路的影响，我们应用Realtime-PCR、免疫组织化学染色检测以上三组IL-6/STAT3通路关键信号分子的变化；同时为进一步验证假设，我们以结肠癌前细胞系IMCE为研究对象，Western blot方法探索IL-6/STAT3通路及其下游关键分子的变化。
　　结果
　　第一部分
　　（1）实验周期12周后胆酸组小鼠肠道肿瘤数量明显增加约2倍，肿瘤数量增多主要出现在中段和远段小肠，小肠各种大小的腺瘤均增加（＜1mm,1-2mm,＞2mm），大肠大腺瘤数量增多。此外，病理学染色显示 CA组小鼠肠道腺瘤发生恶变，在远端小肠，80%出现高级别上皮内瘤变，而对照组仅为腺瘤伴或不伴有低级别上皮内瘤变。Apcmin/+胆酸组小鼠肠道肿瘤Ki-67及β连环蛋白阳性细胞百分比较对照组明显升高，差异具有统计学意义。
　　（2）胆酸组Apcmin/+小鼠巨噬细胞招募显著增加，肠道肿瘤组织间质巨噬细胞的M2型表面分子比例增多，而M1型表面分子比例减少，提示组织存在恶性转化趋势。
　　（3）胆酸上调Apcmin/+小鼠Wnt通路，肠组织E-cadherin和β-catenin表达情况与对照组相比存在显著差异， E-cadherin在细胞膜上的表达减少，β-catenin在细胞浆中表达增加且部分细胞出现细胞核的浓集，Cyclin D1在细胞浆中的表达亦增加。
　　第二部分
　　（1） CA诱导肠道微生态失衡，具体表现为致病菌（如普沃氏菌属、埃希志贺菌属、脱硫弧菌属，还包括一些条件致病菌，如Akkermansia、Bacteroides等菌属）明显增加，益生菌（如乳杆菌、双歧杆菌、产丁酸菌等）明显减少，同时CA致使小鼠肠道菌群多样性发生明显降低。
　　（2）胆酸组Apcmin/+小鼠回盲部短链脂肪酸（包括乙酸、丙酸、丁酸）的水平明显低于对照组。
　　（3） Apcmin/+胆酸组小鼠血清 FITC-D浓度明显高于对照组，提示胆酸处理Apcmin/+小鼠会使其肠道通透性明显增加。同时，胆酸组紧密连接蛋白ZO-1、Claudin3、Claudin7的mRNA相对表达量明显高于对照组，PAS染色、MUC2、defensin、cryptdin免疫组化染色及基因表达提示CA导致杯状细胞及潘氏细胞功能受损。
　　（4）胆酸组Apcmin/+小鼠肠道发生低度炎症，实时荧光定量PCR显示小鼠肠道上皮细胞IL-1β、IL-6及TNF-α相对表达量较对照组明显升高。
　　（5）胆酸组Apcmin/+小鼠肠道胆汁酸水平明显高于对照组，主要表现为进食性DCA水平的增加。
　　第三部分
　　（1）试验周期12周后，胆酸+抗生素组Apcmin/+小鼠肠道腺瘤数目及大小较胆酸组明显降低，病理组织学显示胆酸+抗生素组小鼠肠道肿瘤均为管状腺瘤，恶性度低于胆酸组和对照组。
　　（2）胆酸+抗生素组 Apcmin/+小鼠肠道炎症水平较胆酸组和对照组相比大幅降低。
　　第四部分
　　（1）小鼠肠道组织免洗组织化学染色显示，小鼠肠道IL-6、STAT3、p-STAT3表达明显增加。
　　（2）胆酸组小鼠粪菌液刺激 IMCE细胞系，炎症因子水平增加，上调 IL-6/STAT3通路信号分子及其下游关键分子。
　　结论
　　本文揭示了胆汁酸与肠道菌群的相互作用对肠道腺瘤进展过程的影响，一些可能与肠道炎症相关的细菌，如Akkermansia,等可能是促发腺瘤恶变过程的因素之一，此外，肠道中保护性SCFAs水平的降低，胆汁酸水平的增加及STAT3等肿瘤相关信号通路的活化等均参与其中。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、胆酸喂养Apcmin/+小鼠诱导肠道腺瘤恶变

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3统计学方法

1.4 实验结果

1.5 讨论

1.6 小结

二、胆汁酸与肠道菌群相互作用在肠道腺瘤恶变中的作用

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

2.6 小结

三、整体调控肠道菌群对Apcmin/+小鼠腺瘤恶变发生的影响

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 统计方法

3.4 实验结果

3.5讨论

3.6小结

四、胆酸诱导的肠道菌群失衡对IL-6/STAT3信号通路的影响

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 统计方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

4.6小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:肠道菌群、菌群代谢产物与结直肠癌

致谢

个人简历