YAP蛋白对脂肪功能的影响及其在肥胖相关代谢性疾病中的作用

摘要

【背景】
　　肥胖症，因脂肪细胞增殖异常，脂肪组织过度堆积造成机体生理、病理改变同时伴有体重异常增加。由于生活方式以及膳食结构的改变，目前世界范围内肥胖人口的比率呈显著增加趋势。肥胖会增加罹患糖尿病，冠心病，脑血管疾病，高血压以及高血脂症的发病风险，严重影响人类健康以及生活质量。因此，对于肥胖疾病的深入研究，将有助于其治疗及预防。
　　脂肪组织是机体中最大的内分泌器官，同时还具有储存脂质，调节机体能量代谢平衡的作用。脂肪组织的功能紊乱，会显著影响机体的代谢水平，从而引起一系列代谢紊乱性疾病的发生。Hippo-YAP信号通路首先在果蝇中发现，在哺乳动物体内具有高度保守性，参与调控组织及器官大小。多项研究提示Hippo-YAP信号通路的调控与能量代谢密切相关，并且在3T3-L1细胞中的研究发现YAP的激活可抑制脂肪分化，但对于其在脂肪组织中的功能以及对肥胖相关代谢性疾病的影响缺乏系统的研究，相关机制较为匮乏。
　　【目的】
　　研究YAP在脂肪分化以及脂肪分解中的作用及其机制，探究YAP对肥胖相关代谢性疾病的影响。
　　【方法】
　　构建脂肪组织特异性过表达YAP的转基因小鼠。高脂饮食喂养12周诱导小鼠肥胖模型，检测脂肪组织中YAP变化情况。使用胶原酶消化法，分离小鼠的成熟脂肪细胞，同时结合免疫组织化学方法检测YAP的表达情况。检测无酚红培养基以及小鼠血清中的甘油三酯的含量，评价小鼠脂肪分解的在体水平。实时定量PCR以及蛋白免疫印迹方法，分析与脂肪分解相关分子的表达变化。
　　使用胰酶消化法分离得到转基因小鼠前脂肪细胞以及成熟的脂肪细胞。前脂肪细胞在细胞长到相互汇合时，给予分化液（IBMX0.0115g/mL，胰岛素1mg/mL，地塞米松1mM）处理，收集促分化液处理不同时间点的脂肪细胞，检测分化后YAP的mRNA水平、磷酸化(P-YAP)以及总YAP（T-YAP）的蛋白水平。RT-PCR以及Western Blot检测Hippo-YAP的表达情况。诱导野生型小鼠与脂肪组织 YAP过表达小鼠（YAPtgfAP2Cre+， YAPtgfAdCre+），两种基因型小鼠前脂肪细胞分化，Oil Red O方法比较两者分化能力。Western Blot检测与分化相关的关键因子蛋白水平变化。
　　高脂饮食喂养转基因小鼠12周，油红O染色以及肝脏的脂质抽提检测YAP的表达水平改变后，脂肪功能的改变是否会影响肝脏的脂质沉积。葡萄糖耐量试验（IPGTT）评价小鼠胰岛素抵抗是否有改变。所有实验结果均利用统计学方法进行方差分析或T检验，以P<0.05作为存在显著性差异的标准。
　　【结果】
　　在肥胖早期白色脂肪组织中T-YAP蛋白的降解增加，YAP的mRNA水平加增， P-YAP/T-YAP的比例显著增加；随着肥胖的进展，两组小鼠中P-YAP/T-YAP以及YAP的mRNA同样显著增加，但T-YAP蛋白水平表达差异缩小，提示增加的YAP mRNA不断的对YAP总蛋白进行补充。肥胖过程中YAP的表达改变提示其参与了肥胖的发生发展。
　　为进一步研究YAP对脂肪功能的影响。我们分离野生型小鼠的原代前脂肪细胞并进行培养，发现随着前脂肪细胞分化的发生发展， T-YAP的表达水平明显降低。与此同时，参与前脂肪分化的相关基因C/EBPα，C/EBPβ，PPARγ的表达亦显著增加，表明YAP参与前脂肪细胞的分化过程。而YAPtgfAP2Cre+小鼠的原代前脂肪细胞分化被抑制，同时发现脂肪分化关键核受体在脂肪细胞分化8天后C/EBPα，PPARγ表达水平较对照小鼠显著降低，C/EBPβ有下降的趋势。单位细胞量中甘油的释放量实验显示，过表达YAP小鼠成熟脂肪细胞的甘油释放量显著增加。饥饿状态下的甘油释放结果显示，YAPtgfAP2Cre+较对照小鼠，血浆中甘油水平明显增加。以上结果表明，脂肪组织中过表达YAP抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，同时促进成熟脂肪细胞的分解能力。
　　高脂饮食引起YAPtgfAP2Cre+小鼠脂肪重量和脂肪体重降低，且血清甘油三酯（TG）及胆固醇（CHO）水平明显高于正常小鼠。在 YAPtgfAP2Cre+过表达小鼠中，成熟脂肪细胞的个体形态较正常对照小鼠明显偏小，视野内数量较少。两种YAP过表达小鼠模型均表现出，肝脏脂质沉积状况较正常小鼠严重。肝脏的脂质抽提，结果显示 TG以及 CHO的含量较正常对照小鼠明显增加，在YAPtgfAdCre+小鼠过表达体系中，小鼠表现出显著的胰岛素抵抗。
　　【结论】
　　肥胖的发病过程中脂肪组织P-YAP/YAP以及YAP的mRNA水平显著增加；YAP表达增加可抑制肥胖状态下脂肪组织中前脂肪细胞向成熟脂肪分化、促进成熟脂肪的分解、脂质释放入血，最终加剧肝脏脂质沉积、血脂紊乱以及胰岛素抵抗等肥胖相关代谢疾病的发生。

目录

声明

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、肥胖发生过程中YAP在小鼠脂肪组织中的表达

1.1实验对象和方法

1.2实验结果

1.3 讨论

1.4 小结

二、Hippo-YAP对脂肪分化以及脂肪分解的作用

2.1实验对象和方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

2.4 小结

三、过表达YAP对脂肪功能、胰岛素抵抗、脂肪肝的影响

3.1实验对象和方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

3.4 小结

结论

1.肥胖的发病过程中P-YAP/YAP以及YAP的mRNA水平显著增加。

2.YAP可抑制脂肪的分化能力

3.YAP可促进成熟脂肪的分解能力

4.脂肪组织中YAP表达增加可加重对肥胖相关代谢疾病

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:Hippo–YAP 信号通路在能量代谢中的作用

致谢

个人简历