pCREB在小鼠REM睡眠剥夺模型中对海马PSD-95及炎性因子影响的研究

摘要

目的：
　　1，建立小鼠快速眼动(Rapid eye movement,REM)睡眠剥夺模型，观察睡眠剥夺对小鼠海马细胞核磷酸化的环磷酸腺苷（cAMP）反应原件结合蛋白（pCREB）表达的影响。2，探究睡眠剥夺模型中小鼠海马pCREB表达的变化对突触后致密物质-95(PSD-95)蛋白表达的影响；深入探索pCREB的上游调控机制及其对PSD-95表达的调节作用。3，观察睡眠剥夺后小鼠海马IL-17A、IL-1β、TNF-α三种炎性因子蛋白水平的变化及pCREB对以上三种炎性因子的影响。通过探索睡眠剥夺后小鼠海马突触可塑性相关蛋白及炎性因子表达的变化，进一步探讨睡眠剥夺造成脑损伤及认知功能减退的机制。
　　方法：
　　成年的C57BL雄性小鼠随机分为正常对照组(cage control,CC)、快速眼动期睡眠剥夺(REM sleep deprivation, SD)组，睡眠剥夺+腹腔注射腺苷酸环化酶激动剂毛喉素FSK组(SD+FSK)，SD组睡眠剥夺时间为3天；正常+腹腔注射生理盐水组(CC+V)，正常+腹腔注射蛋白激酶 A(PKA)特异性抑制剂 KT5720组(CC+KT5720)，正常+腹腔注射FSK组(CC+FSK)共6组。
　　1，用改良多平台水环境法（modified multiple platform method，MMPM）建立小鼠REM睡眠剥夺模型。通过免疫荧光染色观察CC组及SD组（各6只）小鼠海马神经元细胞核及小胶质细胞核中pCREB的表达情况。
　　2，腹腔药物注射
　　每天上午9:00向以下四组小鼠腹腔注射相应物质，连续3天。SD+FSK组，小鼠在72h的 REM睡眠剥夺过程中每天早上9点腹腔注射 FSK40ul(15umol/Kg)；CC+V组，生理盐水40ul；CC+KT5720组， KT572040ul(20umol/Kg)；CC+FSK组FSK40ul(15umol/Kg)。
　　3，六组小鼠分批麻醉，CC、SD、SD+FSK三组各6只迅速冰上取海马提取蛋白，用Western Blot检测各组小鼠PKA、pCREB、PSD-95以及IL-17A、IL-1β、TNF-α在不同组别小鼠海马的表达；CC和 SD组各6只用于免疫荧光染色。CC+V、CC+KT5720、CC+FSK三组各12只，其中6只灌注取脑取海马后研碎、离心取上清进行ELISA检测cAMP水平，6只灌注取脑，迅速冰上操作取下海马，提取蛋白组织，通过Western Blot检测各组小鼠PKA、pCREB、PSD-95在不同组别海马的表达。
　　结果:
　　1，小鼠在水平台上进入REM期睡眠后因肌肉松弛反复触水觉醒，成功建立了小鼠REM睡眠剥夺模型；荧光染色发现pCREB在睡眠剥夺组小鼠海马神经元及小胶质细胞核的表达明显降低,差异具有在计学意义(P＜0.05)。
　　2，Western Blot检测显示小鼠海马PSD-95蛋白表达在SD组较CC组明显降低；在SD+FSK组的表达则较单纯SD组增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。ELISA检测显示与CC+V组相比，小鼠海马cAMP的表达在CC+KT5720组降低，在CC+FSK组的表达升高，差异具有计学意义(P＜0.05)。与CC+V组相比，PKA、pCREB、ICER在CC+KT5720组小鼠海马的表达降低，在CC+FSK组的表达升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与CC+V组相比，PSD-95在CC+KT5720组小鼠海马的表达升高，在CC+FSK组减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。Pearson相关性分析表明，PSD-95的表达与pCREB/ ICER的比值呈正相关，与ICER的表达呈负相关。
　　3，Western Blot检测显示IL-17A、IL-1β、TNF-α三种炎性因子在REM睡眠剥夺组小鼠海马的表达均较CC组升高，在SD+FSK组的表达较SD组减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：
　　1，成功建立了小鼠REM睡眠剥夺模型，REM睡眠剥夺抑制小鼠海马组织的神经元及小胶质细胞核蛋白pCREB的表达。
　　2，REM睡眠剥夺抑制小鼠海马组织突触可塑性相关蛋白PSD-95的表达， pCREB在REM睡眠剥夺过程中对小鼠海马组织PSD-95表达有调控作用；
　　上游物质cAMP-PKA不仅调控pCREB的表达，而且影响可诱导的cAMP早期抑制物ICER的表达；小鼠海马PSD-95的表达受到转录相关蛋白pCREB及ICER的共同调节，pCREB相对表达增加能增强PSD-95的表达；而ICER相对表达增加减弱PSD-95的表达。
　　3，REM睡眠剥夺增强小鼠海马组织 IL-17A、TNF-α、IL-1β三种致炎因子的表达；pCREB在REM睡眠剥夺过程中对小鼠海马组织IL-17A、TNF-α、IL-1β表达有调控作用。
　　4，pCREB在REM睡眠剥夺模型中至少通过调节小鼠海马PSD-95及炎性因子的表达两种机制来影响认知功能，其他机制有待进一步探索。

目录

声明

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1 材料和方法

1.1实验动物

1.2 实验仪器

1.3实验试剂

1.4 动物分组

1.5 建立小鼠REM睡眠剥夺模型

1.8 ELISA方法检测不同组别小鼠海马cAMP的表达水平

1.9 Western blot检测小鼠海马相关蛋白的表达水平

1.10 统计学方法

2 结果

2.1免疫荧光染色：pCREB在REM睡眠剥夺小鼠的海马细胞核内的表达

2.2 PKA影响pCREB表达水平，pCREB对PSD-95的表达具有调节作用

2.3 pCREB能改变REM睡眠剥夺小鼠海马IL-17A、IL-1β、TNF-α的表达

3 讨论

3.1 睡眠剥夺导致海马部位的神经元及小胶质细胞核中pCREB的表达降低

3.2 在睡眠剥夺模型中，小鼠海马PSD-95表达的降低与pCREB的调控有关

3.3 REM睡眠剥夺模型中小鼠海马炎性因子表达的变化与pCREB调控有关

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:pCREB对认知功能影响的机制的研究进展

致谢

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