HO-1转染BM MSCs保护减体积肝移植：通过ERK/mTOR途径调节自噬发挥作用

摘要

目的：
　　血红素加氧酶-1（heme oxygenase，HO-1）基因修饰的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM MSCs）可以通过参与调节移植免疫和修复损伤组织来保护移植肝脏，其具体机制尚不明确。自噬是真核细胞生物依赖溶酶体途径降解受损细胞器、蛋白质及不被利用生物大分子的一种高度保守的生物学过程。本实验通过建立大鼠50%减体积肝移植（reduced-size liver transplantation，RSLT）排斥反应模型，研究载有HO-1基因的腺病毒转染BM MSCs（HO-1/BM MSCs）对减体积移植肝脏的保护作用的机制，探讨自噬是否参与及其可能的信号通路。
　　方法：
　　本研究首先提取BM MSCs，将携带目的基因HO-1的腺病毒转染BM MSCs，并制备HO-1/BM MSCs，同时制备大鼠50%减体积肝移植排斥反应模型，将实验分为三组：BM MSCs组、HO-1/BM MSCs组和生理盐水（normal saline，NS）组。移植术后即刻分别为阴茎背静脉注射等量的BM MSCs、HO-1/BM MSCs和NS，并分别于移植术后0、1、3、5、7、10和14 d取各组肝脏组织标本待检。通过透射电镜观察移植肝脏的超微结构；光镜观察肝脏组织的病理学改变及进行排斥反应分级；免疫组织化学染色检测微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein1 linght chain3，LC3）、自噬调控因子Beclin-1蛋白的表达情况；Western blot检测 LC3、Beclin-1、细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、p-ERK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin kinase，mTOR）及p-mTOR相关蛋白含量的变化。
　　结果：
　　1.体外提取培养的BM MSCs经形态学、细胞表面标记及诱导分化能力鉴定，表明BM MSCs形态均一、纯度高及可向成脂、成骨细胞诱导分化；且HO-1成功转染到BM MSCs，转染率达85%以上。建立大鼠50%减体积肝移植排斥反应模型，HO-1/BM MSCs组术后各个时间点急性排斥反应指数均低于NS组和BM MSCs组，术后14 d仍发挥作用，表明HO-1/BM MSCs对排斥和损伤修复的保护作用优于NS组和BM MSCs组。
　　2.移植肝脏超微结构示HO-1/BM MSCs组与NS组、BM MSCs组比较，细胞核固缩不明显、损伤最轻，且双层膜包绕的自噬囊泡数量最多。自噬相关蛋白LC3及Beclin-1表达含量随着移植术后时间推进和排斥反应加重，呈增多现象；且HO-1/BM MSCs组自噬相关蛋白表达含量多于NS组及BM MSCs组。表明，自噬参与HO-1/BM MSCs对减体积移植肝脏的作用。
　　3. p-ERK蛋白随移植时间推进和排斥反应损伤加重基本呈增多趋势，且HO-1/BM MSCs组蛋白表达含量最多，与自噬相关蛋白表达结果一致；p-mTOR蛋白随着移植时间推进和排斥反应损伤加重基本呈减少趋势，且HO-1/BM MSCs组蛋白表达含量最少，与自噬相关蛋白及p-ERK蛋白呈相反表现。上述比较差异均具有统计学意义。
　　结论：
　　本实验验证BM MSCs的提取、HO-1/BM MSCs的制备及50%减体积肝移植排斥模型的建立是符合实验要求的。且HO-1/BM MSCs可更好地发挥对减体积移植肝脏的保护作用；肝组织超微结构形态学表现和自噬相关蛋白的测定证实自噬参与HO-1/BM MSCs对50%减体积移植肝脏的保护作用过程；进一步研究证明ERK/mTOR通路中的相关蛋白参与了自噬的这一作用，即通过上调自噬相关蛋白来增强自噬的发生。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、HO-1基因转染BM MSCs的体外构建及减体积肝移植排斥模型的制备

1.1 实验对象和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

二、自噬参与HO-1/BM MSCs对减体积移植肝的保护作用

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

三、调节自噬参与HO-1/BM MSCs对减体积移植肝作用的机制研究

3.1 实验材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述:自噬与肝移植

致谢

个人简历