依维莫司对顺铂产生抗人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞效应的增效机制研究

摘要

MTOR是一种细胞增殖、凋亡及生存的主要调节分子。MTOR抑制剂，如雷帕霉素，具有免疫抑制作用及抗肿瘤效应。而依维莫司作为雷帕霉素的一种衍生物，也有着抑制MTOR活性的药物学功能。然而，依维莫司是否有抗肿瘤效应却不明确。我们发现使用依维莫司处理人皮肤鳞状细胞癌系COLO-16细胞后，MTOR磷酸化水平下降，LC3-I向LC3-II的转化增加，但自噬流却并未增强；凋亡标志分子caspase3和PARP也并未发生剪切分裂。同时我们也发现依维莫司单独处理细胞时，细胞死亡的一些关键通路并未受到影响；但是与顺铂共同处理细胞时，增强了顺铂诱导的细胞死亡。依维莫司并没有影响顺铂诱导的细胞凋亡，而Chk1(检测点激酶1)的激活却受到了抑制。我们研究证实，依维莫司通过抑制检测点激酶1的激活增强顺铂诱导COLO-16细胞死亡，而且这种效应不依赖于凋亡和自噬调控，发现了依维莫司新的药物效应作用机制。
　　【目的】
　　探讨依维莫司对顺铂的抗人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞效应的增效机制。
　　【方法】
　　分别用50、100、200 nmol/L的依维莫司和25μmol/L顺铂处理人皮肤鳞状细胞癌系COLO-16细胞12、24小时，用AO标记自噬体囊泡并结合溶酶体酶抑制剂分析自噬和自噬流水平。Western印迹分析自噬标记性分子LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化、凋亡和细胞周期相关信号通路，并检测MTOR通路、Chk1磷酸化水平、caspase3和PARP剪切；LDH释放实验分析细胞死亡；Annexin V-EGFP染色分析细胞凋亡。依维莫司与顺铂联合处理的机制实验通过Western印迹进行MTOR、Akt、DNA损伤相关信号以及Chk通路分析。
　　【结果】
　　50、100、200 nmol/L的依维莫司处理COLO-16细胞12、24小时后，MTOR2448位点和2481位点的磷酸化水平降低，Rictor1135位点磷酸化水平也降低。然而，下游信号ULK1蛋白的ser757位点的磷酸化水平、P70 S6激酶的thr389位点的磷酸化水平的变化并不显著。12小时 LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化率分别为3.52±0.21、4.03±0.39、5.05±0.22，两两之间比较，差异无统计学意义（P>0.05），与未用药物处理的对照组（2.07±0.05）比较，差异有统计学意义（P<0.05）。24小时 LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化率分别为3.38±0.26、3.29±0.06、6.57±0.16，两两之间比较，差异无统计学意义（P>0.05），与未用药物处理的对照组（2.61±0.16）比较，差异有统计学意义（P<0.05）。50、100、200 nmol/L的依维莫司联合E64d、pepstatin处理COLO-16细胞12小时后，LC3-Ⅱ与β肌动蛋白的比值分别为1.26±0.40、1.16±0.34、1.21±0.39，与E64d、pepstatin单独处理细胞组（1.19±0.27）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。100 nmol/L依维莫司联合E64d、pepstatin自噬体囊泡表达阳性率2.06±0.61，与E64d、pepstatin单独处理细胞组（1.68±0.62）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。依维莫司处理对Akt的总蛋白水平和磷酸化水平无明显影响。顺铂单独处理COLO-16细胞12、24小时，其中12小时细胞死亡率（%）14.33±3.07，24小时细胞死亡率（%）18.20±1.46。依维莫司单独处理细胞12、24小时时：12小时细胞死亡率（%）0.82±0.47，24小时细胞死亡率（%）8.75±1.17，而顺铂和依维莫司联合处理细胞12、24小时，12小时细胞死亡率（%）28.27±2.12，24小时细胞死亡率（%）42.58±0.93，细胞死亡率明显高于顺铂单独处理时的死亡率。顺铂处理细胞24小时后诱导了caspase3和 PARP的剪切分裂，另外，顺铂处理细胞后，膜联蛋白(annexin)和碘化丙啶（PI）标记的细胞数目增多。而且，顺铂单独处理细胞和联合依维莫司处理细胞24小时，caspase3和 PARP的剪切分裂没有明显的差异，膜联蛋白(annexin)和碘化丙啶（PI）标记的细胞数目也没有明显差异（P>0.05）。而且，顺铂单独处理细胞组与联合依维莫司处理细胞组处理细胞12、24小时LC3-Ⅱ形成、caspase3和PARP剪切、Annexin V标记细胞数均无统计学差异（P>0.05）。顺铂处理COLO-16细胞12、24小时后，Rictor的thr1135位点磷酸化水平和Chk1的ser345位点磷酸化水平明显升高，依维莫司单独处理无类似效应。依维莫司与顺铂联合处理后12和24小时，相对于顺铂单独处理的细胞，上调的Chk1和Rictor磷酸化水平受到明显抑制。
　　【结论】
　　1.依维莫司增强顺铂诱导COLO-16细胞死亡，这种效应不依赖于凋亡和自噬调控。
　　2. COLO-16细胞MTOR通路对依维莫司处理敏感，但其下游信号并非同步产生级联反应。细胞凋亡、Akt通路对依维莫司处理不敏感。
　　3.依维莫司通过抑制检测点激酶1的激活增强顺铂诱导COLO-16细胞死亡，但无加重顺铂所导致的DNA损伤。

目录

声明

符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1对象与方法

1.1研究对象

1.2实验材料

1.3 实验方法

1.4 统计学处理

2 结果

2.1不同浓度的依维莫司对COLO-16细胞的自噬调控

2.2依维莫司对自噬、凋亡等有关的关键信号通路的调控效应

2.3依维莫司对顺铂诱导细胞死亡协同效应的分析

3讨论

结论

参考文献

发表论文及参加科研情况说明

综述:依维莫司的临床应用及其机制研究

致谢

个人简历