IL-17/p38 MAPK通路在小鼠REM睡眠剥夺后海马神经祖细胞增殖的作用机制研究

摘要

目的：
　　观察快速眼动（Rapid eye movement，REM）睡眠剥夺对小鼠海马组织IL-17、IL-17F mRNA、IL-17炎性蛋白、磷酸化 p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)表达及海马齿状回神经祖细胞增殖的影响；进一步探讨REM睡眠剥夺与 IL-17/p38MAPK通路及海马齿状回神经祖细胞增殖的相关性及其可能机制，从而为睡眠剥夺后认知功能受损的防治提供理论依据。
　　方法：
　　成年8-10周C57BL/6J小鼠随机分为6组，每组12只：A组（空白对照组）：适宜环境下饲养1周；B组（睡眠剥夺3天组）：适宜环境下饲养1周，利用改良多平台水环境法进行睡眠剥夺3天；C组（腹腔注射生理盐水组）:适宜环境下饲养1周，腹腔注射生理盐水80ul，3天后处死；D组（腹腔注射外源性IL-17组）：正常环境下饲养1周，腹腔注射重组外源性IL-17溶液80ul，3天后处死；E组（睡眠剥夺3天+DMSO）：正常环境下饲养1周，利用改良多平台水环境法进行睡眠剥夺3天后处死，睡眠剥夺前腹腔注射DMSO50ul；F组（睡眠剥夺3天+SB203580）：正常环境下饲养1周，利用改良多平台水环境法进行睡眠剥夺3天后处死，睡眠剥夺前腹腔注射p38MAPK抑制剂SB20358050ul。所有实验动物在处死之前保证12h光照（9:00-21:00），12h黑暗（21:00-9:00），并在处死之前2h按100mg/kg腹腔注射BrdU溶液。
　　采用实时荧光定量PCR检测各组小鼠海马组织IL-17、IL-17F、β-actin基因表达水平；采用Western-blot检测各组小鼠海马组织IL-17、p-p38、β-actin蛋白表达水平；采用免疫荧光双标观察神经祖细胞标记物SOX2与IL-17RA、IL-17RC的共表达情况，采用免疫荧光染色对各组小鼠海马齿状回p-p38阳性细胞数、海马齿状回增殖阳性细胞数进行计数。
　　结果：
　　1、与A组相比，RT-PCR显示B组小鼠海马组织IL-17、IL-17F mRNA表达水平增加，差异具有统计学意义(分别为P＜0.001，P=0.012)；Western-blot显示B组小鼠IL-17、p-p38蛋白表达增加，差异具有统计学意义（分别P=0.022,P=0.011）；免疫荧光染色显示B组小鼠海马齿状回p-p38阳性细胞数增加，BrdU阳性细胞数减少，差异具有统计学意义(分别P=0.046, P＜0.001）；
　　2、免疫荧光双标发现神经祖细胞标记物SOX2与IL-17RA及IL-17RC共表达；
　　3、与C组相比，D组小鼠海马组织IL-17、IL-17F mRNA表达水平差异无统计学意义(P=0.684,P=0.220)，IL-17蛋白水平增加，差异具有统计学意义（P=0.001）， p-p38MAPK表达增加，差异具有统计学意义(P=0.010)，海马齿状回p-p38阳性细胞数增加，BrdU阳性细胞数减少，差异具有统计学意义(分别 P=0.038,P＜0.001)；
　　4、与E组相比，F组小鼠海马组织IL-17、IL-17F mRNA表达水平、IL-17蛋白表达差异无统计学意义（分别P=0.733，P=0.893，P=0.064），p-p38MAPK蛋白表达减少，差异具有统计学意义（P=0.013），海马齿状回p-p38阳性细胞数减少，差异具有统计学意义（P＜0.001），海马齿状回 BrdU阳性细胞数增加，差异具有统计学意义（P=0.006）。
　　结论：
　　1、REM睡眠剥夺3天后小鼠海马组织海马齿状回增殖细胞减少，可能是睡眠剥夺后认知功能下降的机制之一。
　　2、REM睡眠剥夺3天后海马组织IL-17基因及蛋白水平增加，海马p-p38MAPK蛋白表达增加，p38MAPK通路处于激活状态；
　　3、海马齿状回神经祖细胞表达IL-17 RA及IL-17RC；
　　4、正常小鼠腹腔注射外源性IL-17后海马p-p38MAPK蛋白表达增加，p38MAPK通路处于激活状态，海马齿状回增殖细胞减少；睡眠剥夺前注射p38MAPK抑制剂SB203580后p38磷酸化通路受抑制，海马齿状回增殖细胞增加；IL-17A与神经祖细胞的IL-17受体即IL-17RA及IL-17RC结合，进而激活p38MAPK信号通路，从而影响海马神经祖细胞增殖；
　　5、REM睡眠剥夺后海马齿状回神经祖细胞增殖受抑制的可能机制为：睡眠剥夺促使海马组织IL-17基因及蛋白水平增加，磷酸化p38蛋白表达增加，过度表达的IL-17与神经祖细胞的IL-17RA及IL-17RC结合，激活p38MAPK通路，可能直接抑制海马齿状回神经祖细胞的增殖，也可能进一步影响周围炎性环境，增强其他促炎因子的作用，从而间接抑制海马齿状回神经祖细胞的增殖。
　　综上所述，IL-17/p38MAPK通路与REM睡眠剥夺后小鼠海马神经祖细胞增殖受抑制关系密切，可能是睡眠剥夺后认知功能受损的机制之一，或参与神经退行性疾病的发生发展，IL-17通过激活p38MAPK通路，直接或间接在睡眠剥夺后海马神经祖细胞增殖受抑制发挥重要作用。

目录

声明

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1 材料方法

1.1实验动物

1.2实验仪器

1.3 实验试剂

1.4实验方法

1.5统计学方法

2结果

2.1 睡眠剥夺对 IL-17/p38MAPK 相关指标及海马齿状回神经祖细胞增殖的影响

2.2海马齿状回神经祖细胞标记物SOX-2与IL-17受体IL-17RA/IL-17RC共表达情况

2.3腹腔注射rIL-17对海马IL-17/p38MAPK 相关指标及海马齿状回神经祖细胞增值的影响

2.4睡眠剥夺前注射SB203580对IL-17/p38MAPK相关指标及海马齿状回神经祖细胞增值的影响

3讨论

3.1睡眠剥夺对中枢神经系统免疫炎性因子表达的影响

3.2睡眠剥夺对海马齿状回神经再生的影响

3.3 IL-17/p38通路与海马齿状回神经再生

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:睡眠剥夺对神经再生的影响及其机制研究进展

致谢

个人简历