FATS与PMLIV相互作用并促进细胞凋亡的分子机制研究

摘要

目的
　　染色体脆性位点基因FATS（Fragile-site Associated Tumor Suppressor）是一个抑癌基因，本课题组通过在全基因组规模上采用微阵列-比较基因组杂交（array-CGH）技术分析小鼠肿瘤细胞染色体基因的拷贝数变化在国际上首次发现并命名。已证实FATS可以增加基因组的稳定性，可以正反馈调控基因组稳定性“守门人”—p53分子，而PML是p53的伴侣分子，协同参与DNA损伤诱导的细胞凋亡。本研究的目的是进一步阐明FATS与PML蛋白相互作用，并促进细胞凋亡的分子机制。
　　方法
　　1.利用Western blot技术检测PMLWT/WT和PML-/-的小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblas，MEF）细胞中，FATS的表达量的变化以及过表达FATS是否影响PML的表达水平。
　　2.利用免疫荧光技术检测PMLWT/WT和PML-/-的MEF细胞中，FATS和PML的细胞定位；并利用免疫共沉淀技术，检测二者是否有相互作用。
　　3.构建含有His-tag的PML的6个异构体载体，检测FATS与哪个特异载体相互作用，发现FATS与PML4相互作用后，进一步分析确定FATS对PML的小分子泛素相关修饰（Small Ubiquitin-related Modifier，SUMO）化的影响。
　　4.利用小分子RNA干扰技术，使用Lipofectamine2000瞬时转染PML-siRNA至MEF细胞（PMLWT/WT），降低MEF细胞内源PML表达水平，进行免疫荧光实验，证实PML对PML核体（PML-NBs）形成的作用，进一步确定FATS对PML核体形成的作用。
　　5.用生长曲线实验分析 PML核体增多时，对细胞生长的抑制作用，接下来用Western blot检测凋亡相关标志物-剪切的caspase3的表达，验证是否因为细胞凋亡对生长造成影响并通过流式细胞仪计数细胞死亡数目进一步确认。
　　6.免疫沉淀法检测FATS对PML SUMO化的影响是否与SUMO化过程之中唯一的E2连接酶--Ubc9相关。
　　7.用流式细胞术及凋亡实时荧光检测工具GC3AI两种方法，直观分析Ubc9存在时，过表达FATS对细胞凋亡的作用。
　　结果
　　1. Western blot技术检测显示过表达FATS显著上调PML蛋白表达水平，而PML表达不影响FATS的蛋白水平。
　　2. FATS与PML在细胞核中有共定位现象，并且二者有直接相互作用。
　　3. FATS与PML4特异性的相互作用，且FATS促进PML SUMO化。
　　4.沉默PML表达抑制PML核体的形成，FATS有促进核体增多在细胞内堆积的作用。
　　5. FATS与PML共作用时，对细胞生长的抑制作用有加强效应，凋亡标志物剪切的caspase3表达增多，细胞死亡数目也增多，证实促进细胞凋亡。
　　6. FATS与SUMO化过程中唯一的E2连接酶--Ubc9相互作用。7. Ubc9存在时，过表达FATS促进细胞凋亡。
　　结论
　　FATS与PML在细胞核中共定位并与PML4特异性的相互作用，增强PML SUMO化。PML SUMO化是PML核体形成的必要条件之一，结果证实FATS促进PML核体的形成同时使其在核内堆积，这就导致DNA的合成受阻，细胞凋亡增多；产生这种现象的主要因素是FATS与SUMO化唯一的E2连接酶相互作用，进而促进细胞凋亡。证明抑癌基因FATS因对SUMO化这种蛋白修饰作用造成影响，对抑制肿瘤发展有重要意义。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

材料和方法

1.1实验材料

1.2各实验所需试剂及试剂配制方法

1.3仪器设备

1.4实验方法及步骤

结果

2.1 FATS使PML蛋白表达水平升高

2.2 FATS与PML异构体PMLIV特异性的相互作用且FATS促进PMLIV SUMO化

2.3 FATS诱导PML-NBs堆积并伴随着促进细胞凋亡和抑制细胞增殖

2.4 FATS促进细胞凋亡是通过与UBC9结合实现的

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:MYC对细胞生长和肿瘤代谢调节

致谢

个人简历