间充质干细胞来源exosomes对角膜移植排斥的作用研究

摘要

目的： 虽然穿透性角膜移植(penetrating keratoplasty,PKP)手术较其他器官移植手术成功率要高,但术后排斥反应在手术失败原因中仍占首位.间充质干细胞来源的Exosomes(mesenchymal stem cells derived exosomes,MSCs-exo)可以表达来源细胞免疫功能,参与免疫调控.在前期实验的基础上,本研究应用MSCs-exo对大鼠角膜移植免疫排斥模型进行治疗,观察不同路径、不同剂量、不同时间给予MSCs-exo对角膜移植排斥反应发生和转归的干预情况,明确exosomes治疗途径及治疗机理. 方法： 1.全血贴壁法分离培养Wistar大鼠骨髓来源MSCs,并鉴别Wistar大鼠骨髓来源间充质干细胞.分离提纯并鉴别MSCs来源Exosomes,BCA法测定蛋白浓度,按需配置exosomes浓度. 2.Wistar大鼠提供供体植片,Lewis大鼠作为受体,构建大鼠穿透性角膜移植免疫排斥动物模型.随机分为以下几组: A组:模型组(亦为空白对照组). B组:术后结膜下注射MSCs组. C组:术后结膜下注射PBS组. D组:术后结膜下注射MSCs来源Exosomes组. Da组:MSCs来源Exosomes剂量为1μg(10μg/ml,0.1ml) Db组:MSCs来源Exosomes剂量为10μg(100μg/ml,0.1ml) Dc组:MSCs来源Exosomes剂量为100μg(1000μg/ml,0.1ml) E组:术前结膜下注射PBS组. F组:术前结膜下注射MSCs来源Exosomes组. MSCs来源Exosomes剂量为10μg(100μg/ml,0.1ml) G组:排斥发生后结膜下注射PBS组. H组:排斥发生时结膜下注射MSCs来源Exosomes. MSCs来源Exosomes剂量为10μg(100μg/ml,0.1ml) I组:术后PBS点眼组. J组:术后MSCs来源Exosomes点眼组. MSCs来源Exosomes剂量为10μg K组:术后尾静脉注射PBS组(1ml). L组:术后尾静脉注射MSCs来源Exosomes组. MSCs来源Exosomes剂量为10μg(10μg/ml,1ml). 临床观察角膜植片排斥进展,从角膜混浊程度、水肿程度和新生血管化程度3个方面对角膜植片进行评分,比较各组角膜植片的平均存活时间,判断治疗方案的有效性. 3.动物模型干预后10天,取材C组与Db组大鼠脾脏,分离单个核细胞,BrdU试剂盒法检测MSCs-exo对T细胞增殖能力的影响. 4.取C组及Db组大鼠角膜组织,进行免疫组化实验,观察CD4+T和CD8+T细胞的表达. 5.分离C组与Db组脾脏来源淋巴细胞于ConA刺激下进行培养,提取角膜组织蛋白,ELISA试剂盒法分别检测培养上清液以及角膜组织蛋白中Th1、Th2以及Th17亚群代表因子的分泌水平. 6.取C组及Db组大鼠角膜各4只,匀样提取RNA,制作基因芯片检测全mRNA表达水平,进行基因差异性分析以及通路信号分析. 结果： 1.成功分离并鉴定了MSCs.MSCs贴壁生长,原代呈漩涡状排列.在诱导分化培养基中,细胞呈骨样细胞及脂肪样细胞分化. 2.成功捕获间充质干细胞来源外泌体,电镜下观察呈双层膜样结构,直径45~100nm,外泌体表达CD9、CD63、CD81标志蛋白. 3.成功建立大鼠穿透性角膜移植排斥动物模型,排斥时间稳定在10天左右. 4.比较局部点眼、结膜下注射以及尾静脉注射3个给药路径,分析发现结膜下注射组可以有效延长角膜植片的存活时间,差异具有统计学意义(P<0.05,与A组相比). 5.比较不同剂量MSCs-exo对角膜植片干预情况,发现10μg治疗组为有效剂量. 6.比较术前、术后、排斥发生时三个不同注射时间给药对排斥模型的干预情况.临床观察发现,术后给药为有效时间点,与A组相比具有统计学意义(P<0.05)术前以及排斥时给药,角膜植片存活时间未见明显延长(P>0.05). 7.T细胞增殖实验表明,MSCs-exo治疗组T细胞增殖水平显著下降(P<0.05). 8.ELISA结果显示,MSCs-exo干预组(Db组)可以上调IL-10/IFN-γ水平,降低IL-17在角膜组织中的表达.Db组大鼠体内CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例相较对照组(A组)显著增高(P<0.05). 结论： MSCs-exo可以通过抑制T细胞增殖、调控Th细胞分化以及上调调节性T细胞,改善角膜植片生存情况.在此过程中Th1通路被明显抑制.

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