RAB3B受miR-92a下调并促进肝癌细胞的恶性行为

摘要

目的： 肝癌作为世界上最常见的实体肿瘤之一，其死亡的概率仅次于胃癌和食管癌，位居世界第三位。肝癌的发生发展与许多因素有关，但常见的病因主要包括乙型及丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素等。近年来有研究表明，许多基因的表达及活性的改变可能影响肝癌的发生发展,其中就包括微小RNA（microRNA，miRNA）。miRNA是一类非编码的单链小分子RNA，其大小约22nt。miRNA可以在转录后水平或转录水平调控基因的表达，参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等。近期的研究表明，许多miRNA通过调节其靶基因参与肿瘤细胞的调控，间接发挥类似癌基因或是抑癌基因的功能。RAB3B是RAS家族中的一员，是细胞内信号传导的重要参与者。近期有报道称其可能与肿瘤的发展有关。然而，关于RAB3B对肝癌细胞的恶性行为的影响尚不明确。本研究主要探讨RAB3B在肝癌发生发展中的作用及其上下游调控机制，为今后肝癌的分子诊断及治疗研究可能提供一个新的角度。 方法： 首先利用实时定量PCR技术检测了miR-92a在人正常肝脏细胞和肝癌细胞中的mRNA水平，随后在肝癌细胞QGY-7703和HepG2细胞中,通过过表达或封闭miR-92a，利用集落形成实验、MTT实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测miR-92a对肝癌细胞恶性表型的影响，并用western blot检测了EMT相关分子标志物的表达差异；同时通过生物信息学方法预测出了miR-92a可能的靶基因——RAB3B，并利用荧光报告载体实验验证了miR-92a与RAB3B的直接靶定作用，通过实时定量PCR和western blot技术验证了miR-92a对RAB3B的直接调控作用以及可能存在的调控方式。随后利用RNA干扰技术，结合上述表型实验分析RAB3B过表达后或敲降后细胞表型的变化，研究RAB3B的具体功能。最后，将与RAB3B的相互作用蛋白进行了质谱分析，并检测了其对ATP生成的影响。 结果： 在前期进行实时定量PCR，结果显示miR-92a在肝癌细胞中表达明显上调，而过度表达miR-92a后，可以看出肝癌细胞QGY-7703和HepG2细胞的迁移和侵袭能力明显增强，细胞增殖能力也得到提高，并且使上皮细胞分子标志物E-cadherin表达减少，间皮细胞分子标志物Vimentin表达增加。通过实验进一步证实了miR-92a发挥作用的直接靶基因为RAB3B，并通过深入研究RAB3B的功能后发现，过表达RAB3B表达后细胞迁移和侵袭能力增强，且能够促进EMT过程。实时定量PCR和western blot实验结果表明在肝癌细胞中过表达或是封闭miR-92a可以减少或升高RAB3B的mRNA和蛋白表达水平。进行相互作用蛋白质谱分析后发现RAB3B可能与ATP合成有关，过表达RAB3B可以增加ATP的生成。 结论： RAB3B可能与肝癌的发生发展密切相关，它受miR-92a的调控，并可以促进肝癌细胞的增殖以及迁移和侵袭的能力，且参与到EMT的进程中，同时还可以促进ATP的合成。

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Abstract

一、miR-92a在肝癌细胞中的表达情况以及功能探究

1.1材料与方法

1.1.1实验材料

序列为：5'-ACAGGCCGGGACAAGUGCAAUA-3’

1.1.2实验方法

1.1.2.1 real-time PCR检测肝癌细胞中miR-92a mRNA的表达情况

1.1.2.2 pcDNA3.1/pri-miR-92a质粒的构建

1.1.2.3实验所用肝癌细胞系转染效率的检测

1.1.2.4实时定量PCR方法检测QGY-7703和HepG2细胞在转染pcDNA3/miR-92

1.1.2.5 miR-92a在肝癌细胞中的功能研究

1.2实验结果

1.2.1 Real-time PCR检测肝癌细胞中miR-92a 的表达情况

1.2.2 pcDNA3/miR-92a质粒的构建

1.2.3肝癌细胞转染效率的检测

1.2.4实时定量PCR方法检测QGY-7703和HepG2细胞在转染pcDNA3/miR-92a或

1.2.5 MTT比色法检测miR-92a对肝癌细胞生长活性的影响

1.2.6平板克隆实验检测miR-92a对肝癌细胞集落形成能力的影响

1.2.7体外划痕实验分析miR-92a对肝癌细胞的迁移能力的影响

1.2.8 Transwell 迁移实验研究miR-92a在肝癌细胞中的迁移能力

1.2.9 Transwell 侵袭实验检测过表达或敲降miR-92a对肝癌细胞侵袭能力的影响

1.2.10过表达或封闭miR-92a对EMT进程的影响

图1-9 过表达和敲降miR-92a后EMT分子标志物E-cadherin和Viment

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.1.1细胞系

2.1.1.2主要试剂

2.1.1.3主要仪器设备

2.1.2实验方法

2.1.2.1 miR-92a候选靶基因的确定

2.1.2.2 构建荧光报告质粒pcDNA3/EGFP-RAB3B 3’UTR和3’UTR-mut的

2.1.2.3 通过EGFP荧光报告载体实验验证RAB3B为miR-92a的靶基因

2.1.2.4通过实时定量PCR和Western Blot研究miR-92a对RAB3B mRNA和

2.2 实验结果

2.2.1 RAB3B为miR-92a的预测靶基因

图2-1 生物信息学网站预测RAB3B为miR-92a的靶基因

2.2.2 EGFP荧光报告载体实验验证RAB3B为miR-92a的直接靶基因

图2-2 EGFP荧光报告系统证明了RAB3B可以受miR-92a的影响而下调。

在分别按分组共转过表达或封闭miR-92a的质粒以及pcDNA3/EGFP-RAB3B-3’UTR或

2.2.3实时定量PCR检测miR-92a对RAB3B的mRNA水平的影响

分别转染pcDNA3/miR-92a和ASO-miR-92a以及各自的对照组之后，通过实时定量PCR

2.2.4 miR-92a在肝癌细胞中对RAB3B蛋白水平的影响

在QGY-7703（A）和HepG2（B）细胞中分别转染过表达或封闭miR-92a质粒之后裂取蛋白进

三、RAB3B在肝癌细胞中的功能研究

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.1.1细胞系

3.1.1.2主要试剂

3.1.1.3主要仪器设备

3.1.2实验方法

3.1.2.1过表达RAB3B和敲降RAB3B质粒的构建

3.1.2.2验证过表达和敲降RAB3B质粒表达的有效性

3.1.2.3 RAB3B在肝癌细胞的表达情况

3.1.2.4 RAB3B在肝癌细胞中的功能研究

1、MTT实验检测RAB3B对肝癌细胞的生长活性的影响

2、平板克隆实验检测过表达或敲降RAB3B对细胞增殖能力的影响

3、转染过表达或敲降RAB3B进行体外划痕实验

4、Transwell迁移实验检测RAB3B在肝癌中对细胞迁移能力的影响

5、Transwell侵袭实验检测RAB3B在肝癌中对细胞侵袭能力的影响

6、Western blot实验检测RAB3B对EMT过程的影响

图3-1 过表达和敲降RAB3B质粒的有效性检测

采用实时定量PCR方法检测miR-92a在QGY-7703（A）和HepG2（B）细胞中转染过表达R

3.2.2过表达和敲降RAB3B后对RAB3B蛋白水平的影响

图3-2 过表达RAB3B和敲降质粒的有效性验证

在两种细胞系中转染构件好的过表达及敲降RAB3B质粒，并通过采用Western blot实验进行质粒

Western blot的实验结果与实时定量PCR的结果一致，说明构建的过表达和敲降RAB3B的质粒

3.2.3 RAB3B在肝癌细胞中的表达情况

3.2.4 RAB3B促进肝癌细胞的生长活性

图3-4 过表达或敲降RAB3B对细胞活性的影响

MTT实验检测过表达和敲降RAB3B之后肝癌细胞QGY-7703和HepG2细胞中细胞活性的变化情况

3.2.5 RAB3B对肝癌细胞增殖能力的影响

3.2.6过表达和敲降RAB3B对肝癌细胞相对迁移速率的影响

图3-6 划痕实验测定过表达敲降RAB3B对肝癌细胞迁移能力的影响

A：QGY-7703细胞 B：HepG2细胞

体外划痕实验检测RAB3B对QGY-7703（A）和HepG2（B）细胞迁移能力的影响。结果证明过表

3.2.7 RAB3B能促进肝癌细胞迁移和侵袭能力

图3-7 Transwell 迁移和侵袭实验检测RAB3B对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响

我们在QGY-7703和HepG2细胞中转染了RAB3B过表达和敲降质粒后，进行transwell迁

3.2.8 RAB3B对EMT进程的影响

图3-8 检测过表达或是敲降RAB3B后EMT重要分子标志物的蛋白水平变化

我们分别在QGY-7703（A）和HepG2（B）细胞中转染了过表达或敲降RAB3B的质粒以及各自的

四、RAB3B通过促进ATP的产生影响肿瘤细胞能量代谢

4.1 实验材料与方法

4.1.1.1 细胞系

4.1.1.2主要试剂

4.1.1.3 实验仪器

4.1.2.1 免疫共沉淀方法确定与RAB3B相互作用的蛋白

4.1.2.2 过表达RAB3B后检测ATP水平变化

4.2实验结果

4.2.1 CO-IP方法筛选候选与RAB3B相互作用的蛋白

图4-2 质谱分析后部分结果

4.2.2 过表达RAB3B后检测ATP水平变化

讨论

结论

RAB3B与肿瘤的关系

一、RAB蛋白介绍

二、RAB3B蛋白

三、RAB3B蛋白在肿瘤中的研究