自噬在顺铂诱导食管癌细胞凋亡中的作用及机制研究

摘要

目的：食管癌是全球范围内常见的消化道肿瘤，在我国恶性肿瘤死亡率中排第4位，在全球恶性肿瘤死亡率位列第6，外科手术是治疗可切除食管癌首选的方法，但术后局部复发率高达40%－60%，而接近50%的食管癌患者确诊的时候已有远处转移，失去了手术切除的机会，这些患者只能依赖于化学治疗和放射治疗，顺铂作为食管癌化疗的一线药物，对于食管癌的治疗效果显著。顺铂作为细胞毒性药物杀死肿瘤细胞的机制主要是损伤和抑制DNA的合成。在此过程中激活了多种信号途径（主要为凋亡途径），从而避免或促进细胞的死亡。近年来，大量研究表明，自噬作为另一种细胞死亡形式，可单独或与凋亡共同作用参与化疗药物对肿瘤细胞的影响。本实验目的是验证顺铂是否诱导食管癌EC109细胞的自噬，并进一步探究自噬在顺铂诱导食管癌细胞损伤中的作用，以及其发生作用的具体机制。 方法：①研究对象：体外培养人食管鳞癌EC109细胞株，使用不同浓度的顺铂处理EC109细胞不同的时间点，浓度梯度为1uM、2.5uM、5uM、7.5uM、10uM，每个浓度设0h、12h、24h、48h、72h五个时间点。用CCK-8法检测细胞活力，计算出IC50剂量并确定下一步顺铂干预的浓度及作用的时间。②顺铂干预浓度和时间点的选取与分组：根据CCK-8检测结果，选取5umol/L顺铂，建立不同时间点顺铂处理模型，设正常对照组（NC）、顺铂处理24h组、顺铂处理48h组、顺铂处理72h组。建立不同浓度顺铂处理72小时模型，设正常对照组（NC）、顺铂浓度1uM组、顺铂浓度2.5uM组、顺铂浓度5uM组。检测指标：通过免疫印迹法检测各组EC109细胞自噬标记蛋白LC3-II和Beclin1的表达水平、自噬底物蛋白p62及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、XIAP的表达水平；免疫荧光检测各组EC109细胞自噬标记蛋白LC3的表达；TUNEL法检测各组EC109细胞的凋亡率。③药物干预与分组：给予自噬抑制剂氯喹干预EC109细胞，设正常对照组、氯喹处理组、顺铂处理组、顺铂+氯喹干预组。选取EC109细胞自噬及凋亡表达最明显的顺铂处理时间点和浓度进行处理，即5uM顺铂，处理72h。氯喹预处理方法：氯喹稀释液在顺铂处理前给予预处理2h。检测指标：免疫印迹技术检测各组EC109细胞自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、凋亡相关蛋白cleaved caspase-3及XIAP蛋白的表达变化；TUNEL法检测各组EC109细胞的凋亡率。④SiRNA转染与分组：给予SiRNA干预Atg5的表达，设正常对照组、SiRNA Atg5干预组、顺铂处理组、顺铂+SiRNA Atg5干预组。选取EC109细胞自噬及凋亡表达最明显的顺铂处理时间点和浓度进行处理，即5uM顺铂，处理72h。SiRNA Atg5预处理方法：SiRNA Atg5在顺铂处理前给予转染处理6h。检测指标：免疫印迹技术检测各组EC109细胞Atg5、LC3-Ⅱ、cleaved-caspase-3、及XIAP蛋白的表达水平；TUNEL法检测各组EC109细胞的凋亡率。 结果：①CCK-8结果显示，EC109细胞对顺铂的作用敏感，顺铂对EC109细胞增殖的抑制作用呈剂量浓度效应。随着时间及浓度的增加，细胞增殖的抑制作用明显增加（P＜0.05）。5uM顺铂处理组，细胞增殖抑制率在所有12h、24h、48h、72h均小于50%。②顺铂处理不同时间点EC109细胞自噬的检测：免疫印迹结果示：顺铂处理组自噬标记蛋白自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达明显增多，5uM顺铂处理72h组表达最多，与正常对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；自噬底物蛋白p62表达明显减少，且随着药物浓度的增加及作用时间的延长表达逐渐减少，5uM顺铂处理72h组表达最少，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。免疫荧光结果示：随着顺铂浓度的增加及作用时间的延长，EC109细胞LC3-Ⅱ绿色荧光点增加，5uM顺铂处理72h组表达最高，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。③顺铂处理不同时间点EC109细胞凋亡及XIAP表达的检测：免疫印迹结果示：随着顺铂浓度的增加及作用时间的延长，EC109细胞cleaved caspase-3表达逐渐增多，5uM顺铂处理72h组表达最多，差异具有统计学意义（P＜0.05）；EC109细胞XIAP表达逐渐减少，5uM顺铂处理72h组表达最少，与正常对照组相比，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。TUNEL结果示：随着顺铂浓度的增加及作用时间的延长，EC109细胞凋亡阳性点表达逐渐增多5uM顺铂处理72h组表达最多，差异具有统计学意义（P＜0.05）。④氯喹干预对EC109细胞自噬及凋亡的影响：免疫印迹结果示：与NC组相比，顺铂组LC3-Ⅱ表达增多（P＜0.05），顺铂+氯喹组LC3-Ⅱ表达较顺铂组明显增多（P＜0.05）；与NC组相比，顺铂组cleaved caspase-3表达增多，顺铂+氯喹组cleaved caspase-3表达较顺铂组明显减少（P＜0.05）。TUNEL结果示：与NC组相比，顺铂组EC109细胞凋亡阳性点表达增多（P＜0.05），顺铂+氯喹组细胞凋亡阳性点表达较顺铂组明显减少（P＜0.05）。⑤SiRNA干预EC109细胞自噬及凋亡的影响：免疫印迹结果示：与NC组相比，顺铂组LC3-Ⅱ和cleaved caspase-3表达增多（P＜0.05），顺铂+SiRNA组LC3-Ⅱ和cleaved caspase-3表达较顺铂组明显减少（P＜0.05）。TUNEL结果示：与NC组相比，顺铂组EC109细胞凋亡阳性点表达增多（P＜0.05），顺铂+SiRNA组细胞凋亡阳性点表达较顺铂组明显减少（P＜0.05）。⑥干预自噬对XIAP表达的影响：免疫印迹结果示：与NC组相比，顺铂组EC109细胞XIAP表达减少（P＜0.05）；与顺铂组相比，顺铂+氯喹组和顺铂+SiRNA组XIAP表达增多（P＜0.05）。 结论：本研究证实：①顺铂处理后EC109细胞凋亡增多，并且伴随着自噬的激活以及XIAP表达减少；②氯喹抑制自噬以及SiRNA Atg5干预自噬后，给予顺铂处理，凋亡相关蛋白cleaved caspase3表达减少，细胞凋亡率减低；③氯喹抑制自噬以及SiRNA Atg5干预自噬后，XIAP表达增多。综上所述，得出结论：①顺铂诱导食管癌细胞自噬的激活；②自噬激活加重了顺铂所致食管癌细胞损伤；③自噬可能是通过过度清除XIAP而加重食管癌细胞的凋亡。

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