伯式疟原虫内质网蛋白YOP1在蛋白质分泌中的作用研究

摘要

研究目的： 疟疾是由疟原虫引起的一种严重危害生命健康的全球性传染疾病，其临床症状主要是由疟原虫在宿主红细胞内的无性生长增殖所引起的。疟原虫有多种种属，本文我们重点研究的是鼠源的伯氏疟原虫（Plasmodium bergheiANKA），其可侵染鼠的正常红细胞。成熟红细胞无细胞器与细胞核，疟原虫侵入后可利用自身的内质网合成并分泌大量不同功能的蛋白质至红细胞胞浆或胞膜，从而完成对红细胞结构的重塑，以利于疟原虫摄取营养物质、进行细胞粘附、或逃逸免疫清除等。前期研究表明，伯式疟原虫表达真核细胞保守的内质网蛋白YOP1。YOP1通过诱导膜曲度来稳定管状内质网结构，缺失YOP1会影响内质网管状网络，而管状网络又与蛋白质分泌相关联。本文旨在研究伯式疟原虫YOP1(PbYOP1)的缺失对其蛋白分泌及致病能力的影响，以便寻找干扰疟原虫蛋白质合成与分泌的新方法，为疟疾疫苗的研制提供可靠的理论依据。 研究方法： 第一部分：利用野生型（wt）和YOP1缺失（Δyop1）的伯式疟原虫分别感染Wistar大鼠，通过伯式疟原体外同步化培养技术得到大量发育至裂殖体时期的疟原虫化的红细胞并同时富集未感染疟原虫的红细胞。选用两种不同的红细胞及疟原虫蛋白提取方法进行研究：其一是胰蛋白酶膜表面处理法，即在富集的感染与未感染红细胞沉淀中加入胰酶溶液，处理一段时间后取其上清，用BCA法测上清中的蛋白浓度，同时将上清做定性与定量质谱并统计对比，此方法主要研究的是暴露于红细胞膜表面的蛋白质种类与含量；其二是低渗破膜法，将相同数量未感染与感染的红细胞用低渗破膜液处理后，分别取所有的疟原虫与红细胞膜沉淀，用蛋白质电泳的方法检测不同组所有蛋白质的表达量差异，并将蛋白质胶条做定性质谱，统计不同组红细胞膜与疟原虫相关蛋白质种类与含量的差异。 第二部分：利用wt和Δyop1的伯式疟原虫分别感染BALB/C小鼠，在感染的不同时期分别取两组鼠的脾脏与肝脏，以未感染疟原虫的鼠肝脾为对照组，利用实时荧光定量技术检测不同脏器的炎症因子及其内质网应激分子的相对表达量，进一步探究伯式疟原虫YOP1的缺失对不同组织脏器致病能力的影响。 研究结果： 第一部分结果显示：用胰酶膜表面处理组中，wt疟原虫感染的红细胞表面蛋白浓度高于Δyop1，并且二者均高于未感染红细胞组；质谱结果表明感染疟原虫后红细胞膜表面或胞浆中整合了大量疟原虫相关蛋白质，并且红细胞自身蛋白质的种类与含量出现了不同程度的上调与下调；PbYOP1基因缺失影响了疟原虫蛋白质的分泌，使得红细胞中疟原虫相关蛋白质的种类相比较wt组有所下降，其蛋白含量主要以下调为主，部分种类的疟原虫分泌蛋白在Δyop1组并未检测到。低渗处理法组中wt和Δyop1组全部的红细胞膜与疟原虫沉淀跑胶的胶条结果用ImageJ软件统计分析，结果显示wt组与Δyop1组总蛋白含量无统计学差异；质谱结果显示PbYOP1缺失组疟原虫分泌蛋白质的种类出现下降。 第二部分结果显示：感染疟原虫后，随着感染天数的延长，鼠肝脾内质网应激分子和炎症相关因子的表达量逐渐升高，其中在感染中晚期，Δyop1组其因子表达量相比较wt组出现显著下降，在感染的早期两组无显著差异。 研究结论： 伯式疟原虫YOP1的缺失会降低其分泌蛋白的种类，蛋白含量以下调为主，并且PbYOP1的缺失会显著降低伯式疟原虫对鼠肝脾脏器的致病力。这些结果为深入研究伯氏疟原虫YOP1的生理功能奠定了重要基础。

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