母亲糖尿病合并肥胖对后代的影响及机制研究

摘要

目的： 观察母亲孕前患2型糖尿病合并肥胖对胎盘线粒体功能及其后代代谢紊乱的影响.体外模拟高糖及高脂环境,观察其对人胎盘滋养层细胞的生物学功能的影响. 方法： 1.选取健康孕妇,单纯孕前2型糖尿病孕妇,单纯孕前肥胖孕妇,孕前2型糖尿病合并肥胖孕妇作为研究对象,每组各24例.记录母亲年龄、孕前体质量、体质量指数(body mass index,BMI)、孕期体质量增长、胎龄等参数.收集各组孕妇娩出的胎盘组织,分离胎盘线粒体.采用试剂盒分别测定四组胎盘的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、线粒体含量、ATP水平、线粒体呼吸链复合物活性.提取各组胎盘线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA),采用RT-PCR法检测胎盘线粒体DNA表达水平.应用免疫荧光染色和western blot测定各组胎盘组织Nrf2及HO-1的表达. 2.选取健康孕妇,单纯孕前2型糖尿病孕妇,单纯孕前肥胖孕妇,孕前2型糖尿病合并肥胖孕妇及其新生儿作为研究对象,每组各40例.记录新生儿出生体质量、胎龄等参数.收集四组孕妇其胎盘娩出后脐静脉血.根据试剂盒操作说明检测新生儿脐带血中抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、脂质氧化终产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)、胰岛素、血糖、瘦素(Leptin,LEP)、游离脂肪酸(Nonesterified fatty acid,NEFA)、脂联素(adiponectin,ADP)、甘油三酯,并用采用线性回归分析探讨每组胎儿脐血MDA、CAT、GSH-PX与新生儿脐血血清学代谢指标胰岛素、血糖、LEP、NEFA、ADP、甘油三酯的相互关系. 3.对胎盘滋养层细胞进行常规培养及传代,在对数生长期收集胎盘滋养层细胞.将胎盘滋养层细胞分为4组进行不同的处理.即分为高糖处理组-HG(high glucose)(30mmol/L葡萄糖处理)、高脂处理组-HL(high lipids)(0.3mmol/L棕榈酸处理组)、高糖合并高脂处理组-HG/HL以及空白对照组-CON.采用CCK-8试剂检测各组胎盘滋养层细胞增殖情况.检测各组细胞培养24,48和72小时后超氧化物歧化酶(reactive oxygen species,SOD)水平、MDA活性及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平.采用TUNEL法检测各组细胞培养48小时后的凋亡率.透射电镜观察各组细胞内部超微结构变化.检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性.Western blot及免疫荧光检测各组细胞线粒体损伤及氧化应激相关蛋白Nrf2、HO-1、SMAC、Cyt-C的表达情况. 结果： 1.四组之间母亲年龄、胎龄之间无显著统计学差异(P>0.05).孕前肥胖组和孕前糖尿病合并肥胖组的体质量、BMI以及孕期体质量增长明显高于对照组和孕前糖尿病组(P<0.05).孕前糖尿病组体质量、BMI及孕期体质量增长均高于对照组(P<0.05).孕前糖尿病合并肥胖组的ROS水平、NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)水平高于对照组、孕前糖尿病组以及孕前肥胖组(P<0.05).对照组、孕前糖尿病组以及孕前肥胖组的SOD水平显著高于孕前糖尿病合并肥胖组(P<0.05).此外孕前糖尿病组的SOD水平明显低于对照组以及孕前肥胖组(P<0.05).孕前糖尿病合并肥胖组的ATP水平显著低于对照组、孕前糖尿病组及孕前肥胖组(P<0.05).除此之外,孕前糖尿病合并肥胖组mtDNA的拷贝数也明显低于其他各组(P<0.05).孕前糖尿病组的mtDNA拷贝数低于对照组、孕前肥胖组(P<0.05).孕前肥胖组mtDNA拷贝数显著低于对照组mtDNA拷贝数(P<0.05).孕前糖尿病组的mtDNA拷贝数低于对照组、孕前肥胖组(P<0.05).孕前糖尿病合并肥胖组的线粒体呼吸链复合物I活性明显低于对照组、孕前肥胖组和孕前糖尿病组(P<0.05).孕前糖尿病合并肥胖组和孕前糖尿病组的线粒体呼吸链复合物Ⅱ*Ⅲ活性也比对照组更低(P<0.05),而孕前糖尿病合并肥胖组和孕前糖尿病组之间、对照组和肥胖组之间线粒体呼吸链复合物Ⅱ*Ⅲ活性均无显著差异(P>0.05).复合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性在四组之间无统计学差异(P>0.05).Western blot检测显示孕前糖尿病合并肥胖组、孕前糖尿病组的Nrf2和HO-1蛋白表达明显低于对照组和孕前肥胖组(P<0.05). 2.孕前糖尿病合并肥胖组脐血抗氧化剂CAT与GSH-PX水平显著低于其余各组(P<0.05),孕前糖尿病合并肥胖组MDA水平显著高于其余各组(P<0.05).孕前糖尿病合并肥胖组比孕前糖尿病和对照组中的脐血胰岛素、LEP、NEFA和ADP水平明显增高(P<0.05).然而四组之间脐血葡萄糖和甘油三酯水平无明显差异(P>0.05).孕前糖尿病合并肥胖组中,脐血LEP水平与抗氧化剂CAT、GSH-PX,以及MDA均存在相关性(P<0.05),ADP与抗氧化剂CAT、GSH-PX存在相关性(P<0.05).而且回归分析显示孕前糖尿病合并肥胖组,LEP与CAT、GSH-PX水平成负相关,LEP与MDA水平成正相关(P<0.05);脂联素与CAT、GSH-PX水平成负相关(P<0.05).四组中胰岛素和NEFA与CAT、GSH-PX、MDA均无明显相关性(P>0.05). 3.CCK-8检测显示在24、48及72小时三个时间点,四组胎盘滋养细胞数量均有统计学差异(P<0.05).并且对照组的细胞数量显著高于高脂组及高糖合并高脂组(P<0.05),而高糖和高糖合并高脂组的细胞数量在24小时时则有统计学差异(P>0.05).高糖、高脂及高糖合并高脂组细胞LDH渗漏均显著高于对照组,并且高脂组渗漏在三个时间点也均高于高糖组(P<0.05),高糖合并高脂组细胞的LDH渗漏最显著.对照组细胞的SOD水平在24、48及72小时三个时间点均显著高于其余三组(P<0.05),而高糖合并高脂组的的SOD水平显著低于其余各组(P<0.05).对照组细胞的MDA水平均显著低于其余三组(P<0.05),而高糖合并高脂组的的MDA水平显著高于其余各组(P<0.05).对照组的细胞凋亡率仅为1.1%,而高糖合并高脂组的细胞凋亡率高达35.2%,显著高于其余各组(P<0.05).高糖合并高脂组的线粒体复合物I及IV的活性显著低于其余三组(P<0.05),而高糖与高脂组之间的差异无统计学意义(P>0.05).高糖合并高脂组胎盘滋养细胞的Nrf2及HO-1蛋白均显著低于其余三组(P<0.05),而高糖组及高脂组的Nrf2及HO-1蛋白相对表达量也有所下降,且均低于对照组(P<0.05).高糖合并高脂组的线粒体中SMAC、Cyt-C相对表达最低(P<0.05),而高糖、高脂组的细胞线粒体中SMAC、Cyt-C较对照组也有显著的下降,但仍高于高糖合并高脂组(P<0.05).高糖合并高脂组的细胞线粒体损伤较其余各组更为明显,存在线粒体肿胀,局部萎缩,线粒体膜不完整等表现. 结论： 1.孕前糖尿病能够通过抑制Nrf2/ARE通路(抗氧化反应元件)损害孕妇胎盘氧化应激调节功能,引起胎盘线粒体功能损伤.而孕前肥胖则更进一步加重孕前糖尿病对孕妇胎盘的氧化应激损伤. 2.母亲孕前糖尿病合并肥胖能够影响其后代糖代谢及脂代谢.并且孕前糖尿病合并肥胖者后代的氧化应激与其脂质代谢指标相关. 3.高糖和高脂都能够对胎盘滋养层细胞产生氧化应激损伤,而高糖/高脂两种因素同时刺激对胎盘滋养层细胞的损伤更明显,并且这一损伤可能通过抑制Nrf2/ARE信号通路发挥作用.

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