外泌体在肌肉萎缩症中的诊疗作用研究

摘要

目的： 肌肉萎缩症是一类致死性遗传疾病，其中，临床上较为常见的一类肌肉萎缩症为杜兴肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy-DMD），是由DMD基因发生移码突变导致其编码的功能性dystrophin蛋白缺失所引起。临床表现为进行性肌肉萎缩及认知能力下降，是一类神经肌肉失调症。另外一类较为常见的肌肉萎缩症为dysferlin肌病，其临床表征异质性较高，是由于编码跨膜蛋白dysferlin蛋白的DYSF基因发生突变，导致dysferlin蛋白表达下调而引起的一种肌肉萎缩症，其发病时间较晚。临床上针对肌肉萎缩症的诊断，主要依赖于肌肉组织活检，但该方法是一种侵入性强的诊断方法，对病人造成精神和身体上的伤害较大，因此，新型非侵入式的诊断策略研发迫在眉睫。同时临床上对肌肉萎缩症还缺乏行之有效的治疗方法，亟需研发新型、高效和安全的治疗手段和策略。近年来，外泌体（exosome）作为一种细胞分泌的天然生物纳米级囊泡结构，其所具有的低免疫原性、来源广泛和结构稳定等重要特性，尤其是exosome可携带源细胞来源的蛋白、脂类、mRNA和microRNA等多种信息，因此可作为细胞信使，在疾病诊断与治疗中显示出巨大的应用潜力。基于此，在本研究中，拟探究exosome在肌肉萎缩症诊疗中的应用可行性和潜力，以期为肌肉萎缩症诊治提供一种新方法和策略。 方法： 从健康人和dysferlin肌病患者的血清和尿液中，利用超速离心的方法提取exosome，并利用电镜、纳米检测仪和Western blot进行形态和表达谱鉴定。利用Western blot检测并比较健康人和患者血清及尿液来源exosome中dysferlin蛋白的表达水平，以探究携带dysferlin的exosome是否可用于dysferlin肌病的诊断。利用ELISA检测并比较血清和尿液来源exosome中dysferlin表达，以建立该方法的临床诊断标准。利用Western blot检测其他类型肌肉萎缩症患者血清及尿液来源exosome携带相关功能蛋白的表达水平，以探究exosome在其他肌肉萎缩症诊断的可行性。 为探究exosome对肌肉萎缩症的治疗作用，分别在dysferlin肌病和DMD肌肉萎缩症模型上进行了系统测试。在dysferlin肌病测试中，利用Western blot对不同细胞来源的exosome进行dysferlin表达鉴定，筛选高负载dysfelrin蛋白的exosome（EXOdysf）。利用激光扫描共聚焦显微镜检测PKH67标记的exosome在dysfelrin缺失细胞（DYSF-/-）内的定位情况，采用Western blot及免疫荧光染色方法检测exosome处理的细胞中dysferlin蛋白的表达及定位情况，以确认EXOdysf作为运输载体的可行性及效率。将EXOdysf与DYSF-/-细胞共孵育48小时，利用双光子激光扫描共聚焦显微镜对肌管膜进行损伤，以测试EXOdysf对DYSF-/-细胞膜损伤修复的作用；利用免疫荧光染色检测受损DYSF-/-细胞膜表面溶酶体标志性蛋白LAMP-1的表达，以确定EXOdysf是否通过恢复dysferlin蛋白表达，从而促进溶酶体在细胞膜损伤修复过程中的作用；通过对细胞损伤修复过程荧光探针Fluo-3AM标记的Ca2+流的变化，以探究EXOdysf是否可以调节膜损伤后Ca2+稳态。利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统，对人DYSF基因外显子22和55进行缺失突变，获得dysferlin蛋白表达缺失的人细胞模型；将人血清来源exosome（EXOser）与dysferlin蛋白表达缺失细胞共孵育，利用Western blot检测dysferlin蛋白的传递及表达；通过膜损伤修复试验检测血清来源exosome在人源细胞模型上对膜损伤修复的作用。 在DMD模型的测试中，利用DMD疾病模型mdx小鼠，收集不同细胞来源exosome，按150μg/只exosome剂量，以腹腔注射的方式，每周注射两次，连续注射3周。通过小鼠抓力的测试、血清肌酸激酶（CK）等方法来检测肌肉功能是否得到改善。利用体重变化的监测、肝脏和肾脏生化指标评估其安全性。利用H&E肌肉病理切片染色、炎症细胞标志性蛋白的免疫组织化学染色以及炎症因子RT-PCR定量分析检测肌肉组织病理上的改善情况。利用血清免疫球蛋白（IgG）染色来探究肌细胞膜完整性的改变；利用Western blot检测肌肉再生与分化相关的标志性蛋白的表达，以探究exosome对肌肉再生与分化功能的影响，并利用CTX急性损伤模型进行确认。通过Western blot和免疫荧光染色检测dystrophin相关蛋白复合体的表达及定位，以探究exosome对dystrophin蛋白相关功能蛋白复合体的恢复情况。针对dystrophin蛋白功能复合体的表达恢复及正确定位，利用Western blot、RT-PCR和免疫荧光染色分别从蛋白转运、mRNA水平改变、糖基化转移酶表达水平以及胞内蛋白酶体的表达及活性进行检测，以阐释exosome改善损伤肌肉功能的机制。 结果： 1.发现dysferlin肌病患者与健康人血清及尿液来源exosome上dysferlin蛋白表达呈现显著性差异，证明血清及尿液来源exosome上dysferlin蛋白表达差异可作为dysferlin肌病的诊断指标；并建立了检测血清exosome上dysferlin蛋白表达的ELISA方法，确立了其可用于dysferlin肌病临床诊断范围。 2.通过对其他肌肉萎缩症患者血清及尿液来源exosome上相关功能蛋白的检测，为exosome用于相关疾病的临床诊断提供了证据。 3.对不同细胞来源exosome中dysferlin蛋白表达水平测试，发现H2K肌管来源exosome（EXOdysf）上dysferlin蛋白表达水平较高。进而对EXOdysf的标志蛋白表达、形态、大小表征及膜上的定位研究结果表明：EXOdysf表达exosome的标志蛋白CD63、Alix和CD9，呈现为茶托状的纳米级囊泡结构；dysferlin蛋白定位在exosome的膜及细胞质内。通过EXOdysf在DYSF-/-细胞中摄取和细胞内定位试验，结果表明：EXOdysf可高效地将所负载的dysferlin蛋白输送到细胞内，并在细胞膜上正确定位，显示出exosome可作为膜蛋白运输载体的潜力。在DYSF-/-细胞模型上，对EXOdysf修复肌细胞膜损伤能力的测试，结果表明：EXOdysf通过恢复DYSF-/-细胞中dysferlin蛋白的表达，进而改善细胞膜损伤修复能力及溶酶体在膜损伤修复中的作用，并进一步调节肌肉细胞中Ca2+稳态。在此基础上，利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统，成功获得了人DYSF基因外显子22和55缺失突变的人源dysferlin蛋白缺失细胞模型。在两个细胞模型上，通过测试人血清来源exosome（EXOser）对dysferlin蛋白缺失的人肌肉细胞膜损伤修复作用，结果表明：EXOser可高效介导dysferlin蛋白运输及dysferlin蛋白缺失的人肌肉细胞膜损伤修复作用，并且EXOser适用于不同突变类型，具有普适性。 4.在mdx小鼠模型上对不同细胞来源exosome系统测试结果显示，不同细胞来源exosome均可显著提高mdx小鼠抓力、显著降低血清CK值，说明exosome能够改善mdx小鼠肌肉功能。血生化分析结果显示：与未治疗组相比，治疗组中肝脏和肾脏功能相关的生化指标无显著性变化；在治疗过程中，小鼠体重无明显变化，说明exosome未表现出相关毒性。对exosomes治疗的mdx小鼠中，不同肌肉病理检测结果表明：exosome能够改善肌纤维降解与坏死，降低炎症因子表达，抑制炎症细胞浸润。通过检测肌肉膜上血清免疫球蛋白的表达水平，发现exosome治疗后肌肉膜上血清免疫球蛋白表达降低，说明exosome可改善肌细胞膜的完整性。在mdx及CTX急性损伤小鼠模型中，对exosome治疗后肌肉肌纤维再生与分化相关蛋白的检测结果发现：exosome能够促进损伤肌肉的再生与分化；并且提高mdx小鼠肌肉中dystrophin相关功能蛋白复合体中dystroglycan和sarcoglycan蛋白表达及在肌肉膜上的正确定位。对其作用机制的研究结果表明：exosome可能通过抑制蛋白酶体的表达和活性，从而稳定和提高mdx小鼠肌肉中dystrophin相关功能蛋白复合体表达和正确定位。 结论： 1.人血清和尿液来源的exosome可作为dysferlin肌病及其他相关肌肉萎缩症新型的低/非侵入性诊断手段，为dysferlin肌病及其他相关肌肉萎缩症临床诊断提供了新工具。 2.Exosome可作为膜蛋白的有效运输载体，介导dysferlin蛋白的运输和正确定位，并改善细胞膜损伤修复及膜内钙离子稳态的作用，为dysferlin肌病提供一种新治疗策略和模式。 3.Exosome可提高mdx小鼠肌肉功能，改善肌纤维膜的稳定性和肌肉炎症状态，促进肌纤维再生与分化，为DMD治疗提供了一种新治疗思路和模式。 4.在mdx小鼠上，对exosome作用机制的初步研究表明：exosome可能通过抑制蛋白酶体表达和活性，从而稳定骨骼肌及心肌中dystrophin相关蛋白复合体表达及其肌肉膜上的正确定位。

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